研究背景:结直肠癌是常见的高危害消化系统恶性肿瘤,其发病率在女性中位于恶性肿瘤第2位,在男性中位于恶性肿瘤第3位。结直肠癌肿瘤细胞的生长依赖于肿瘤本身的特性和周围复杂的微环境,肿瘤微环境中数量最多的细胞是巨噬细胞,所以巨噬细胞对肿瘤细胞生长的影响也是当前研究热点,巨噬细胞包括2种亚型,即M1型和M2型,M1型巨噬细胞释放细胞炎症因子,促进免疫反应来抑制肿瘤细胞的增殖和邻近组织的损伤,M2型巨噬细胞释放促进相邻细胞增殖和组织修复的细胞因子,并且具有抑制免疫反应和促进肿瘤生长的作用。DDX39是Dead-Box蛋白,是一类ATP依赖的RNA解旋酶,目前发现DDX39在肿瘤上皮中的表达水平对肿瘤细胞生长有影响,但在肿瘤间质中的表达,特别是巨噬细胞的表达暂无相关研究。本论文拟对DDX39蛋白表达和结直肠癌预后的关系,及DDX39对巨噬细胞的极化作用做初步探讨。研究目的:观察结直肠癌中DDX39蛋白水平的表达与预后的关系,并统计分析间质中DDX39的表达与不同间质细胞数量的关系,降低巨噬细胞中DDX39的表达对其向M1或M2型巨噬细胞极化方向的影响,并做初步探讨。研究方法:1.DDX39蛋白在结直肠癌组织中的表达及与预后的关系根据824例人结直肠癌组织的石蜡切片免疫组织化学染色结果,结合病人临床病理参数及预后信息,探究DDX39蛋白水平的表达对结直肠癌预后的影响。2.结直肠癌组织间质中DDX39的表达与巨噬细胞的关系对824例人结直肠癌组织的石蜡切片进行免疫组化染色,观察间质中DDX39与CD163、CD66b、POSTN、FOXP3蛋白表达的关系,选择关系最密切的蛋白进行免疫荧光共定位。3.DDX39对巨噬细胞的极化作用用PMA 200ng/ml将THP-1细胞系诱导为巨噬细胞,48h后加入LPS 10pg/ml和IFN 20ng/ml,极化为M1型巨噬细胞;加入IL-4 20ng/ml和IL-13 20ng/ml,极化为M2型巨噬细胞。PCR法检测各巨噬细胞亚型中TNF-α、IL-6、IL-1β、CD163、DDX39的表达。降低M0型巨噬细胞中DDX39的表达,观察TNF-α、IL-6、IL-1β、CD163的变化,判断巨噬细胞极化方向的改变。研究结果:1.经组织芯片免疫组化发现DDX39蛋白表达于上皮和间质的胞浆和胞核中。统计分析发现结直肠癌组织上皮和间质中DDX39的表达与正常、癌旁、腺瘤中的表达差异均有统计学意义。上皮中DDX39蛋白的表达水平与肿瘤部位、分化程度、TNM分期、血清CEA、血清CA199、肿瘤复发转移的差异均有统计学意义(均p<0.05);间质中DDX39蛋白的表达水平在肿瘤部位、TNM分期、血清CEA、血清CA199、肿瘤复发转移的差异具有统计学意义(均p<0.05)。上皮中DDX39低表达组较高表达组的总生存率和无病生存率低、预后差,差异有统计学意义(P=0.000);间质中DDX39低表达组较高表达组总生存率和无病生存率低、预后差,差异有统计学意义(P=0.000)。患者总体生存期的Cox单因素分析显示,肿瘤分化程度、血清CEA、上皮DDX39表达水平、间质DDX39表达水平是结直肠癌预后的影响因素;Cox多因素分析显示,肿瘤分化程度、上皮DDX39表达水平、间质DDX39表达水平是结直肠癌预后的独立影响因素。患者无病生存期的Cox单因素分析显示,肿瘤分化程度、TNM分期、血清CEA、上皮DDX39表达水平、间质DDX39表达水平是结直肠癌预后的影响因素;Cox多因素分析显示,肿瘤分化程度、上皮DDX39表达水平、间质DDX39表达水平是结直肠癌预后的独立影响因素。2.通过免疫组化,分别选用CD163标记M2型巨噬细胞、CD66b标记中性粒细胞、POSTN标记成纤维细胞、FOXP3标记T细胞,再分别分析间质中DDX39的表达与上述蛋白的相关关系,研究发现,DDX39在间质的表达与CD163关系最为密切,Spearman系数r=-0.627,呈明显的负相关。通过20例结直肠癌石蜡切片的免疫荧光发现DDX39与巨噬细胞标志F4/80存在共定位,说明巨噬细胞表达DDX39。而DDX39与CD163的免疫荧光没有发生共定位,间质中CD163高表达的区域基本无DDX39的表达,而DDX39高表达的区域CD163表达量也较少。3.通过PCR发现,M2型巨噬细胞相比M1型巨噬细胞高表达CD163的同时,DDX39表达降低,说明DDX39可能是M1型巨噬细胞的标志。敲除M0巨噬细胞的DDX39后,CD163升高,说明巨噬细胞有向M2型极化的趋势。结论:1、上皮DDX39表达水平、间质DDX39表达水平是结直肠癌预后的独立影响因素。2、DDX39在间质的表达与CD163关系最为密切,在蛋白水平呈明显的负相关。3、DDX39与CD163在RNA水平呈负相关,DDX39降低可能促进巨噬细胞向M2型极化。