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脑梗死是目前常见的难治性脑血管疾病,且具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率及并发症多的特点。目前治疗急性脑梗最为有效的就是溶栓治疗,但是溶栓受严格的治疗时间窗(4.5小时)的限制且存在一定的风险。急性脑梗死分为缺血梗死区与半暗带区,缺血半暗带是指电活动终止但仍保持正常的离子平衡和结构且细胞结构完整的可逆性脑损伤,一般位于梗死边缘区,中心坏死区由于完全性缺血导致脑组织细胞大量死亡,但半暗带区仍存在侧支循环,尚有大量可存活的神经元,因此挽救这部分可逆性损伤神经元成为了急性期脑梗死治疗的关键。细胞自噬和凋亡之间相互关联,它们影响着细胞内的稳态,同时细胞自噬和凋亡过度都会进一步损伤脑组织。血脑屏障是血液和脑组织之间的一道特殊屏障,它可以防止有害物质进入大脑,并且还可以传输营养物质,脑缺血缺氧导致血脑屏障通透性增加,引发脑水肿、炎症反应等继发性脑损害。因此本研究主要通过行为学、病理学、影像学、分子生物学等方法,从细胞凋亡、细胞自噬以及血脑屏障等角度探讨醒脑静对脑缺血急性期半暗带损伤的保护作用,为醒脑静注射液在脑缺血急性期的临床用药提供依据。目的:1建立大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,造模后于不同时间点行MRI检测,观察大鼠脑梗死面积大小,脑水肿形成情况,以及大鼠梗死体积的变化,并且通过影像学相关软件,将DWI、PWI联合应用判定各组缺血半暗带的变化。2采用HE染色和透射电镜方法观察脑组织缺血半暗带区域的病理学变化,TTC染色观察脑梗死范围大小,免疫组化结合分子生物学方法检测脑缺血半暗带神经细胞凋亡相关蛋白(Caspase-3),自噬相关蛋白(Beclin-1)以及血脑屏障通透性相关蛋白(ZO-1,Claudin-5)表达的变化。3探讨解毒通络中药醒脑静通过调节细胞凋亡、自噬以及血脑屏障紧密连接相关蛋白的表达的变化保护半暗带的途径和机制,为在“病络—毒损脑络”理论指导下中医药早期干预缺血性中风病提供理论和实验依据。方法:1采用SPF级健康雄性SD大鼠40只,其中2只用于假手术组,余下38只制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组以及醒脑静组,术后尾静脉注射给药并且采取mNSS神经功能评分法,通过从感觉、运动及反射等方面对其进行评分,造模后4.5小时,24小时以及7天MRI检测以下参数:T1WI,T2WI,PWI,DWI及MRA,从影像学角度观察大鼠不同时间段下脑梗死面积大小以及脑水肿情况,并计算半暗带丢失率。2采用SPF级健康雄性SD大鼠100只,除外假手术组,其余按上述方法制备大鼠MCAO模型并随机分为模型组和醒脑静组,术后尾静脉注射给药,2次/天,分别于术后4.5小时,24小时以及7天进行mNSS神经功能评分,在每一时间点各取25只大鼠,麻醉后开胸,心脏左心室穿针并且剪开右心耳,0.9%生理盐水冲洗结束后用4%多聚甲醛固定脑组织,用4%多聚甲醛浸泡24小时以上后再固定切片,采用HE以及电镜方法观察大鼠脑组织半暗带区域的病理变化,免疫组化法检测凋亡相关蛋白(Caspase-3)以及紧密连接相关蛋白(ZO-1)在脑组织中的表达。3按照上述方法制备模型后,给药以及神经功能评分方法同前,术后4.5小时,24小时以及7天在低温条件下完成大鼠断头取脑,剔除多余组织,将大鼠右侧半暗带区域脑组织放入冻存管中,置于液氮罐中保存,采用Western blot法检测自噬以及紧密连接相关蛋白 Beclin-1、ZO-1、Claudin-5 的表达。结果:1整体评价情况:mNSS神经功能评分发现,MCAO大鼠术后4.5小时治疗组与对照组之间并没有表现出明显的神经功能缺损的差异(P>0.05),而MCAO术后24小时以及7天可见醒脑静组大鼠的神经功能状态要优于模型组(P<0.05),而且MCAO大鼠术后24小时各组评分都要高于7天。从MRI的图像以及相关数据来看,醒脑静的脑梗死面积在各个时间段均小于对照组,4.5小时半暗带体积醒脑静组小于模型组,CBF梗死体积也减小。根据半暗带丢失率的比较情况可以发现模型组半暗带的丢失率高于醒脑静组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2病理学改变:HE染色可见假手术组神经元细胞形态完整,细胞间间隙正常,血管内皮完整,血管周围未见水肿,模型组可见明显的血管周围有星型细胞足突水肿,神经元固缩,细胞凋亡以及炎细胞侵润,醒脑静组血管相对比较完整,部分有轻度的周围水肿,少量神经元固缩。尼氏体染色观察各组间尼氏体形态的改变,可见假手术组尼氏体结构完整,呈嗜碱性斑块或颗粒状,大而多,形如虎皮花纹,分布均匀,模型组尼氏体结构破坏崩解成吸尘状颗粒,醒脑静组尼氏体形态要优于模型组。电镜下观察脑组织半暗带区超微结构可发现除了 HE染色所见到的病理表现外还可以看到模型组有较多固缩的神经元,各时间段模型组血脑屏障紧密连接扩张明显,且血管内皮基底膜受损严重,相比模型组醒脑静组在星形胶质细胞水肿,核固缩,以及紧密连接完整性上都要优于模型组。3免疫组化结果:Caspase-3在镜下呈现棕褐色颗粒状,多为散在分布,正常组织中亦可以见到该蛋白的表达。MACO大鼠术后4.5小时可见醒脑静组和模型组Caspase-3的表达未见明显差异(P>0.05),MCAO术后24小时以及7天,模型组Caspase-3的表达远高于醒脑静组,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。ZO-1蛋白免疫阳性物质呈深褐色,镜下呈点状或块状分布,在正常脑组织中较高表达。MCAO大鼠术后4.5小时,24小时和7天,醒脑静组的ZO-1蛋白均表达明显高于模型组(P<0.01)。4 Western结果:假手术组中Beclin-1蛋白有大量的表达,与此相比模型组Beclin-1蛋白表达则相对较少。MACO大鼠术后4.5小时,醒脑静组Beclin-1蛋白表达高于模型组(P<0.05),与模型组相比差异在24小时的时候更为明显(P<0.01);MCAO大鼠术后4.5小时醒脑静组Claudin-5蛋白量的表达高于模型组(P<0.05),术后24小时Claudin-5蛋白虽表现出相同的趋势,但差异未见统计学意义(P>0.05);Western blot结果显示术后4.5小时和24小时模型组中ZO-1蛋白的表达量少,而醒脑静组ZO-1蛋白相比模型组表达有所上调,两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。讨论:1从病理学改变来看,假手术血管内皮、神经细胞等组织形态均正常,模型组镜下可以看到血管周围水肿明显,神经细胞坏死,炎细胞浸润等这些均符合缺血性脑梗死的病理改变,可以提示造模成功。2从影像学表现以及神经功能评分等整体评价均可以发现均可以发现醒脑静组脑梗死面积小于模型组,且24小时脑梗死面积达到最大,而且24小时醒脑静脑水肿面积小于模型组,说明醒脑静在一定程度上能够缓解脑水肿。另外醒脑静组的半暗带丢失率少于模型组,说明脑梗死急性期醒脑静组半暗带区域转化为不可逆的梗死组织较模型组少,从而在一定程度上说明它挽救了一部分半暗带。3从电镜下观察半暗带区超微结构来看,醒脑静组神经细胞形态,血管内皮基膜以及血脑屏障紧密连接的完整性均要优于模型组,说明醒脑静注射液可以保护神经元,减少血脑屏障通透性,从而防止进一步脑损伤。4从免疫组化以及western结果来看,醒脑静注射液可以通过上调自噬相关蛋白Beclin-1以及下调凋亡相关蛋白Caspase-3的表达来减少神经元的丢失,维护细胞内环境的稳态。另外醒脑静注射液可以防止紧密连接相关蛋白ZO-1以及Claudin-5蛋白的丢失,从而保护血脑屏障的完整性,减轻脑水肿、氧化应激等继发性脑损伤。