背景肺癌是我国最常见的肿瘤之一,近年的发病率有增长的趋势,严重威胁人类的健康。尽管近年在肺癌的治疗上取得很大的进展,但治疗后的耐药、复发、转移等问题仍是肺癌患者长期生存的巨大障碍。肺癌发生发展机制中仍有许多不解之谜。这些谜底的不断揭示,将为肺癌的个体化治疗提供更多的靶点。许多研究表明在胚胎发育具有重要作用的信号通路在肿瘤的发生发展过程中也扮演举足轻重的作用,如Wnt、Norch、TGF及hedghoge等信号通路。多项对Hedgehog信号通路在肿瘤作用的研究显示,这条调控胚胎发育的重要信号通路在包括人类皮肤基底细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌及小细胞肺癌等在内的多种肿瘤的发生发展过程中都有异常激活。哺乳动物的Hedgehog信号通路主要由三个配体：Sonic hedgehog (SHH)、Desert hedgehog (DHH)、Indian hedgehog (IHH),两个跨膜受体Petched(PTCH)、Smothen (SMO),三个转录因子GLI1、GLI2、GLI3及下游的靶基因等组成。目前,对Hedgehog信号在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的作用机制尚不清楚,尽管已经有几项对SHH-GLI1/GLI2激活途径在NSCLC中作用的研究,但对于HH/GLI3通路在NSCLC中的表达模式及与其临床意义仍然未知。目的探索HH/GLI3信号通路SHH、DHH、IHH、SMO及GLI3蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况及其潜在的临床意义。系统研究三个配体SHH、DHH、IHH与下游转录因子GLI3蛋白表达的相关性,为进一步阐明肺癌发生发展过程中的分子机制,以寻找肺癌诊断与治疗新靶点提供理论依据。方法收集广东省肺癌研究所1994年2月至1997年12月存档的非小细胞肺癌切除组织石蜡标本共418例,经经验丰富的病理科医生复习阅片后重新构建组织芯片。所有患者术前均未进行放疗、化疗及其它抗肿瘤治疗,临床病理资料完整。应用免疫组织化学方法检测肺癌组织中SHH、IHH、DHH、SMO及GLI3蛋白的表达情况,根据肿瘤组织细胞的染色率和染色强度进行判定。目标表达部位染色：无(0分)；淡黄色颗粒(1分)；黄褐色颗粒(2分)；深褐色颗粒(3分)；目标表达部位阳性细胞比例：0-5%(0分)；5%-25%(1分)；26%-50%(2分)；51%-100%(3分)；两者相乘；以<6分为低表达组；≥6分为高表达组。应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行分析；各分子表达与临床病理参数的检验采用卡方检验分析,理论频数有小于5者采用Fisher确切概率法分析；等级资料采用两个独立样本的Mann-Whitney U检验；单变量生存分析用Kaplan-Meier法,各亚组间差异比较用Log rank分析；多变量分析使用Cox回归；GLI3与上游配体SHH、DHH、IHH的相关性用偏相关分析；配对的肺癌组织与癌旁正常组织之间表达差异用配对样本的Wilcoxon秩和检验；以a=0.05(双侧)为检验水准,P<0.05为有统计学意义。结果1.SHH高表达同高分化肺癌相关SHH主要在NSCLC组织的肿瘤细胞中表达,亚细胞定位在细胞浆。SHH可评估组织共有343个,其中SHH高表达者占87.2%(299／343),低表达者占12.8%(44／343)；SHH表达水平与年龄、性别、病理类型、TNM分期、T分期、远处转移及淋巴结转移等临床病理参数均无关,但与分化程度有关,SHH表达越高则分化程度越高(非参数检验Mann-Whitney U test, P=0.044)。进一步的病理亚型分层分析显示,在肺腺癌中SHH表达水平与各临床病理参数均无关。但在肺鳞癌中SHH表达与分化程度有关,SHH表达越高则分化程度越高(非参数检验Mann-Whitney U test, P=0.005)。2.DHH同临床病理参数无关DHH主要在NSCLC组织的肿瘤细胞中表达,亚细胞定位在细胞浆。DHH可评估组织共有316个,其中高表达者占81.3%(257／316),低表达者占18.7%(59／316)；DHH表达水平与年龄、性别、病理类型、TNM分期、T分期、远处转移、淋巴结转移及分化程度等临床病理参数均无关。进一步的病理亚型分层分析显示在肺腺癌及鳞癌中DHH表达与各临床病理参数均也无关。3.间质IHH高表达同分期相关IHH在NSCLC组织的肿瘤细胞及间质细胞均有表达,亚细胞定位在细胞膜和细胞浆。肿瘤细胞IHH可评估组织共有343个,高表达者占51.9%(178／343),低表达者占48.1%(165／343)；间质细胞IHH可评估组织共有326个,高表达者占76.7%(250／326),低表达者占23.3%(76／326)；上皮IHH表达与年龄、性别、病理类型、TNM分期、T分期、远处转移、淋巴结转移及分化程度等临床病理参数均无关；但间质IHH表达与年龄(卡方检验,P=0.046)、TNM分期(卡方检验,P=0.036)及T分期有关(卡方检验,P=0.020),年龄越大、TNM分期及T分期越晚则间质IHH表达越高。进一步的病理亚型分层分析显示在肺腺癌及鳞癌中肿瘤细胞IHH表达水平与年龄、性别、TNM分、T分期、远处转移、淋巴结转移及分化程度等临床病理参数均无关；但在肺腺癌中间质IHH表达与年龄有关,年龄越大则间质IHH表达越高(卡方检验,P=0.021)。在肺鳞癌中间质IHH表达T分期有关,T分期越晚则间质IHH表达越高(卡方检验,P=0.011)。4.SMO高表达同高分化肺鳞癌相关SMO主要在NSCLC组织的肿瘤细胞中表达,亚细胞定位在细胞膜和细胞浆。SMO可评估组织共有374个,其中高表达者占87.2%(326／374),低表达者占12.8%(48／374)；SMO表达水平与年龄、性别、病理类型、TNM分期、T分期、远处转移、淋巴结转移等临床病理参数均无关；但与分化程度有关,SMO表达越高则分化程度越高(非参数检验Mann-Whitney U test,P=0.049)。进一步的病理亚型分层分析显示在肺腺癌中SMO表达水平与年龄、性别、TNM分期、T分期、远处转移、淋巴结转移及病理分级等临床病理参数均无关。但在肺鳞癌中SMO表达与分化程度有关,SMO表达越高则分化程度越高(非参数检验Mann-Whitney U test, P=0.034)。5.GLI3高表达同淋巴结转移相关GLI3主要在NSCLC组织的肿瘤细胞表达,亚细胞定位在细胞浆和细胞核。GLI3可评估组织共有365个,其中GLI3高表达者占44.7%(163／365),低表达者占55.3%(202／365)；GLI3表达水平与年龄、性别、病理类型、TNM分期、T分期、远处转移及分化程度等临床病理参数均无关；但与淋巴结转移有关,有淋巴结转移者GLI3表达水平显著较无淋巴结转移者高(卡方检验,P=0.018)。进一步的病理亚型分层分析显示在肺腺癌中GLI3表达水平与年龄、性别、TNM分期、T分期及远处转移的临床病理参数均无关,但与淋巴结转移和分化程度有关,有淋巴结转移者GLI3表达水平显著较无淋巴结转移者高(卡方检验,P=0.036),并且GLI3表达越高则分化程度越差(非参数检验Mann-Whitney Utest, P=0.021)。在肺鳞癌中GLI3表达水平与年龄、性别、TNM分期、T分期、远处转移、淋巴结转移及分化程度等临床病理参数均无关。6.GLI3表达与肿瘤上皮IHH和SMO表达呈正相关相关分析显示在腺癌中GLI3表达与肿瘤上皮IHH(r=0.216,P=0.017)及SMO(r=0.316,P=0.000)表达呈正相关。而肿瘤上皮IHH表达又与间质IHH表达呈正相关(r=0.187,P=0.038)。在鳞癌中GLI3表达与DHH(r=0.283,P=0.009)、肿瘤上皮IHH(r=0.259,P=0.017)及SMO(r=0.228,P=0.037)表达呈正相关。但肿瘤上皮IHH表达与间质IHH表达的相关关系无显著性意义(r=0.188,P=0.087)。7.GLI3在癌组织中表达显著高于正常组织为进一步探讨转录因子GLI3在癌组织及癌旁组织中表达是否有差异,我们用16对肺癌及癌旁正常肺组织中GLI3表达水平的原始评分行配对样本的Wilcoxon检验分析。秩号的符号由“癌组织表达水平-癌旁正常组织表达水平”决定,负秩号(Negative Ranks)有2例；正秩号(Positive Ranks)有11例；持平(Ties)有3例。负秩号的平均秩次为3.00,正秩号的平均秩次为7.73,以正秩号占优势,说明GLI3在癌组织中表达显著高于正常组织,两者表达差异有统计学意义(配对秩和检验,P=0.005)。8.GLI3低表达组的中位总生存期显著高于高表达组单变量生存分析显示SHH、DHH及SMO的表达水平与NSCLC患者的生存无关,进一步的病理亚型分层分析也未显示与肺腺癌和鳞癌患者的总生存有关。但GLI3表达水平与生存相关,GLI3低表达组的中位总生存为37.2个月,高表达组的中位总生存为27.9个月,两者比较生存期差异有统计学意义(Log-rank test, P=0.021)。因为GLI3为核转录因子,因此我们单独分析了GLI3在细胞核中的表达水平与生存的关系,结果显示GLI3细胞核低表达组的中位总生存为33.9个月,高表达组的中为总生存为28.4个月,两者比较生存期差异有统计学意义(Log-rank test, P=0.049)。进一步在肺腺癌和鳞癌这两种最常见的NSCLC病理亚型中进行生存分析,发现这种表达对预后的影响主要表现在肺腺癌中。在腺癌中,总体上GLI3低表达组的中位总生存为41.7个月,高表达组的中位总生存仅为25.6个月,二者差异有显著性意义(Log-rank test, P=0.013)。细胞核中GLI3低表达组中位总生存为40.8个月,高表达组的中位总生存为26.2个月,细胞核中GLI3高表达的肺腺癌患者其预后明显较低表达腺癌患者差,二者差异有显著性意义(Log-rank test, P=0.016)。此外,在腺癌中间质IHH表达水平与生存也有关；间质IHH低表达组的中位总生存为50.8个月,而其高表达组的中位总生存仅为27.9个月,间质IHH高表达患者的预后明显较低表达者差,二者差异有显著性意义(Log-rank test, P=0.021)。在肺鳞癌中各分子的表达与生存均无关。进一步行COX回归分析,纳入变量有性别、年龄、分化程度、远处转移、淋巴结转移、T分期、IHH表达水平及GLI3表达水平,结果显示细胞核的GLI3表达水平是肺腺癌患者预后的独立影响因素(HR=1.640,95%CI=1.100-2.443,P=0.015)。结论1.HH信号通路分子SHH、DHH、IHH、SMO及GLI3在非小细胞肺癌组织中均有广泛表达。2.GLI3在非小细胞肺癌组织中的表达水平明显高于正常组织,并且其表达水平与淋巴结转移有关,因此GLI3过表达对肺癌的发生发展可能起到促进作用。3.在腺癌中GLI3及间质IHH高表达者的预后显著较低表达者差,且细胞核的GLI3表达水平可作为肺腺癌预后的独立预测因子。4. HH-GLI3信号通路在肺腺癌和鳞癌中可能有不同的作用机制。在腺癌中可能通过旁分泌的作用调控GLI3活性,而在鳞癌中则可能是通过自分泌方式调控通路活性。