论文部分内容阅读
背景与目的炎症影响成骨分化研究现状我国每年骨折患者约有5000万人,其中骨不连的发病率约为2%～5%。临床大部分骨不连由开放性骨折感染导致,其产生的疼痛、肢体功能和心理障碍等给患者带来极大痛苦,同时也增加患者和社会的经济负担,因此针对骨不连的机制研究成为目前的热点。骨形成过程为成骨细胞活性与破骨细胞活性相互拮抗制约、矛盾统一的平衡过程,其中成骨细胞由间充质干细胞（MSC）分化而来,主要合成骨基质；破骨细胞由骨髓单核巨噬细胞分化演变而成,主要降解骨基质。骨折愈合过程需要大量新生成骨细胞,进而加快骨质合成与钙化,增加骨体积与密度。目前对于慢性持续性炎症刺激可以促进骨吸收的相关研究已较为成熟,但慢性持续性炎症刺激在骨形成过程中对成骨细胞分化的影响,尤其对MSC分化为成骨细胞的影响至今却所知甚少。尽管学者们不断探索,然而到目前为止,炎症微环境下成骨细胞分化的调控机制仍尚未完全了解。作为机体的一种防御反应,正常生理性炎症反应有利于骨折愈合。但由于感染或其它因素等引起的长期慢性炎症反应则对骨折愈合则毫无益处。目前研究已证实类风湿性关节炎、雌激素缺乏或者老化等患者血液中肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-alpha, TNF-a）的表达量均有所提高。作为体内最重要的促炎性细胞因子之一,TNF-α除参与介导免疫应答外,还通过诱导局部炎症反应和调节外周组织细胞的增殖、分化、凋亡和功能活性影响组织器官的发育和功能。而TNF-α对成骨细胞功能的调节则表现在以下几个方面：（1）TNF-α直接抑制成骨细胞的分化成熟及成骨；（2） TNF-α刺激成骨细胞分泌破骨性调节因子进而促进骨吸收；（3） TNF-α诱导成骨细胞凋亡、减少其数目从而抑制骨形成；（4） TNF-α影响其他促分化细胞因子或生长因子对成骨细胞的调节作用。体外实验目前已证实TNF-α可抑制成骨细胞关键的转录因子如Runx2和Osterix因子的表达。其中TNF-α对Runx2的抑制作用主要通过造成Runx2mRNA的失稳定进而影响细胞凋亡；并且TNF-α还通过对成骨细胞内的Smurfl和Smurf2因子的增量调节来促进Runx2的降解。而TNF-α对Osterix抑制则通过独立的机制,即通过包括MAPK,神经酰胺和氧自由基等信号传导通路间接抑制Osterix活性,进而抑制成骨细胞分化。尽管如此,TNF-α抑制成骨细胞的机制复杂仍不甚清楚。因此探索炎症刺激影响成骨细胞分化的机制,寻找潜在的理想药靶阻止炎症因子对骨再生的抑制,一直是该研究领域密切关注并亟待解决的问题。蛋白质组学在成骨分化研究方面的研究炎症刺激作用下成骨细胞分化的过程存在复杂精密的调节体系,涉及诸多信号通路的调控。考虑到信号通路之间存在的交谈（cross talk）作用,加之既往研究多通过某一条或某几条通路入手,因此难以全面地解释成骨细胞在炎症刺激作用下的分化过程。同时前期的研究多数通过单个靶点阻断单一信号通路干预炎症对成骨细胞分化的抑制。而多靶点组成的靶场干预应该是阻止炎症因子对骨再生抑制的发展方向。只有通过对炎症刺激影响成骨细胞分化的机制深入了解,发现潜在的特异性和可药性靶标,才能做到有的放矢,针对组合靶标开发新的促进炎症刺激下成骨细胞分化的药物。后基因组时代,蛋白质作为生物功能的执行者已经成为生命科学领域的研究热点。蛋白质组学是对机体、组织或细胞的全部蛋白质的表达水平、蛋白修饰与功能、蛋白之间的相互作用等进行高通量的筛选和分析,比传统的单个基因研究或单个蛋白研究更能增加疾病诊断、预后判断的可靠性,更能够准确反映机体的状态。如果运用传统的生化技术手段一个个地去研究这些蛋白质,工作量非常巨大,几乎不可能完成,而找到一些新的发病机理就显得更加困难。因此作为一种全新的系统生物学研究方法,蛋白质组学技术为揭示炎症影响成骨细胞分化的机制提供了强有力的帮助。目前在成骨细胞的研究方面,蛋白质组学分析主要集中于两类内容：1)间充质干细胞定向成骨细胞分化的蛋白质组学分析,找到差异表达的蛋白并进行机制探索；2)利用试验动物,研究各种生物及机械刺激对成骨细胞的形成以探讨成骨细胞的各种反应机制。以上成骨细胞的蛋白质组学研究取得了很多进展与突破,初步揭示了成骨细胞形成的部分分子机制,发现了一些与成骨细胞分化的相关蛋白。但上述研究缺乏动态性,考虑到成骨细胞分化的发展进程中,蛋白质表达为高度动态变化过程,单个时间点的研究难以获得系统全面的蛋白变化信息。同时针对炎症刺激作用下成骨细胞分化过程中蛋白的差异表达的研究尚未见报道。本课题从成骨细胞正常分化及炎症微环境下分化的生物学差异出发,利用高通量的iTRAQ技术联合质谱鉴定的蛋白质学策略,动态研究并筛选与炎症刺激下成骨细胞分化相关的蛋白,并对该蛋白的功能进行验证,研究结果为探索炎症微环境下成骨细胞分化机制及寻找特异性和可药性的组合药靶治疗提供新思路和理论依据。本论文主要包括以下四章内容：第一章炎症刺激下成骨细胞分化细胞模型建立及验证本章实验主要以TNF-a作为刺激物、BMP-2诱导C2C12肌源细胞分化形成成骨细胞构建炎症刺激下的成骨细胞分化模型,通过组织化学染色检测ALP活性和ALP荧光定量分析验证模型的有效性,为我们下一步蛋白组学分析奠定实验基础。第二章基于iTRAQ技术的炎症刺激下成骨细胞分化相关蛋白组学分析为了更好的理解炎症刺激下成骨细胞分化机制,寻找干预炎症微环境下成骨细胞分化的特异性和可药性的组合药靶,本实验运用采用iTRAQ化学标签分别对炎症刺激组和正常分化组蛋白样品的酶解肽段进行标记,并进一步对混合标记样品进行多维液相色谱分离-串联质谱鉴定的技术路线筛选潜在的可能与炎症刺激下成骨细胞分化过程相关的差异蛋白。并对差异蛋白进行生物学分析,探讨差异蛋白在参与炎症刺激下成骨细胞分化过程可能发挥的作用。第三章炎症刺激下成骨细胞分化相关差异蛋白的表达验证不同水平的验证研究可以更加完整地认识炎症刺激下成骨细胞分化机制以及药靶蛋白的开发。本部分研究工作采用采用基于质谱的多反应监测（Multiple Reaction Monitoring, MRM）技术,Q-PCR和Western Blotting对候选蛋白ELP2和SERCA3进一步表达验证,提供证据证明在其在炎症环境下成骨细胞分化过程中具有重要作用。第四章候选药靶蛋白ELP2生物学作用的基本机制探讨ELP2又命名为STAT3-interacting protein1（StIP1），调控STAT3信号通路。蛋白质组学筛选并鉴定发现ELP2在正常成骨细胞分化过程中表达上调,而在炎症刺激下表达下调。目前其对炎症刺激下成骨细胞分化的影响尚未见报道。为探讨ELP2对炎症刺激对成骨细胞分化的影响,构建靶向ELP2的SiRN进行基因沉默,探讨靶向ELP2的SiRNA对成骨细胞分化的影响。沉默ELP2后能够明显改善TNF-α对BMP-2诱导成骨分化的抑制。本实验为揭示炎症刺激下成骨细胞分化机制,寻找特异性和可药性的药靶蛋白提供了新的思路。材料方法：1.细胞株：小鼠肌源细胞株C2C12（ATCC CRL-1772）。口2.细胞模型：细胞分为四组,加入不同刺激物继续培养。1)对照组：细胞悬液中不加入任何药品；2)BMP-2组：在细胞悬液培养体系中加入l00ng/ml BMP-2;3) TNF-α组：将浓度为5ng/ml的TNF-α与细胞悬液一起孵育；4)BMP-2+TNF-α组：在培养体系中同时加入上述浓度的BMP-2和TNF-α。3.碱性磷酸酶（ALP）荧光活性测定及染色测定：为了比较细胞成骨分化情况,将细胞分别按5×103个/孔接种于24孔板内,细胞培养3天后细胞溶解,ALP活性用荧光检测试剂盒检测,采用PNPP法测定碱性磷酸酶活性反映成骨细胞分化程度。波长选择405nm,酶联免疫检测仪测定各孔光密度值并记录结果。细胞培养7天后细胞溶解,进行ALP染色测定（按照Alkaline Phosphatase Staining Kit操作说明进行）。4.基于iTRAQ技术筛选差异蛋白：细胞蛋白提取及定量后,完成iTRAQ试剂的标记及检测,预备LC/MS/MS分析用混合样品,经过强阳离子（SCX）交换、反相液相色谱分离后进行ESI质谱鉴定。对质谱数据分析进行蛋白的检索和鉴定,完成差异蛋白的筛选。5.差异蛋白生物学分析：对差异蛋白进行分子功能（Molecular Function）、所处的细胞位置（Cellular Component）、参与的生物过程（Biological Process）的GO分析、COG注释以及GO富集分析,寻找与差异蛋白质显著相关的生物学功能。完成蛋白质-蛋白质相互作用分析,并通过Pathway显著性富集能确定差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。6.炎症刺激成骨细胞分化过程中差异蛋白筛选：依据模式识别和数据挖掘的聚类分析以及总体差异蛋白的交集处理,筛选参与炎症影响成骨细胞分化过程中的差异蛋白。7.MRM：目标蛋白Transition筛选后基于MRM+EPI模式对transition的色谱峰进行验证,过MRM检测目标蛋白子离子的峰强度,整合计算离子峰面积的大小,从而可以比较目标蛋白在不同样本中的表达差异。8. Western Blotting:抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影。9. RT-PCR:抽提细胞总RNA,逆转录成cDNA后采用sybgreen法完成PCR扩增。以2-ΔΔCt值代表基因的相对表达强度进行相对定量。10. siRNA靶序列的设计合成及转染：根据靶基因ELP2mRNA序列设计并合成3对得分最高的靶向ELP2基因的siRNA。C2C12细胞于含10%FBS的DMEM培养液,37℃,5%CO2的温箱中培养。转染前一天用不加抗生素的培养基培养,当细胞汇合度达30%～50%时采用脂质体法将化学合成siRNA转入C2C12细胞,倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。11.统计分析：采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理。多组均数比较采用单向方差分析,多重比较方差齐性时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’sT3法。检验水准α=0.05。结果1.炎症刺激下成骨细胞分化细胞模型建立及验证：单独或联合应用BMP-2与TNF-α成骨细胞的成骨活性差异有统计学意义（F=134.18,P=0.00）。与对照组相比,单独应用BMP-2可显著增加成骨细胞的成骨活性（P=0.01）；与BMP-2组相比,TNF-α可显著降低成骨细胞的成骨活性（P=0.00）；联合应用BMP-2和TNF-α与单独应用BMP2相比较,差异有统计学意义（P=0.01）,联合应用BMP-2和TNF-α与单独应用TNF-α相比较,差异有统计学意义（P=0.02）。结果显示TNF-α可显著抑制BMP-2诱导的成骨细胞分化。2. ITRAQ试剂标记四组C2C12肌原细胞（Control, BMP-2, TNF-α, BMP-2+TNF-α） LC MS/MS鉴定分析出365,226个质谱,其中得到21,807个肽段以及4,822个差异蛋白点。其中最终达到严格定量标准（比值≥1.5或≤0.6）的差异蛋白点：正常组与分化组（aN113-VS-bB114）22个,分化组中上调7个,下调15个；对照组与炎症组（aN113-VS-cT115）33个,炎症组中上调25个,下调8个；分化组与分化炎症组（bB114-VS-dBT118）71个,分化炎症组中上56个,下调15个。最终交集处理筛选得到5个炎症刺激成骨细胞分化过程中的差异蛋白,即S100-A4, ATPase inhibitor （mitochondrial）, Cytochrome b5, SERCA3和ELP2。其中S100-A4, ATPase inhibitor （mitochondrial）, Cytochrome b5和ELP2在正常分化过程中下调而在炎症刺激的分化过程中上调；SERCA3在正常分化过程中上调而在炎症刺激的分化过程中下调。3.炎症刺激下成骨细胞分化相关差异蛋白的表达验证结果：采用MRM技术、Western Blotting以及RT-PCR对进行表达验证,结果显示ELP2在正常成骨细胞分化过程中表达上调,而在炎症刺激下表达下调；SERCA3在正常成骨细胞分化过程中表达下调,而在炎症刺激下表达上调。其中RT-PCR结果显示单独应用BMP-2或BMP-2联合应用TNF-α后ELP2的表达量差异有统计学意义（F=94.33,P=0.00）。与对照组相比,单独应用BMP-2可显著降低ELP2的表达量（P=0.00）；与BMP-2组相比,BMP-2联合应用TNF-a后ELP2的表达量显著升高（P=0.00）。同样,单独应用BMP-2或BMP-2联合应用TNF-a后ATP2A3的表达量差异有统计学意义（F=88.54,P<0.00）。与对照组相比,单独应用BMP-2可显著升高ATP2A3的表达量（P=0.00）；与BMP-2组相比,BMP-2联合应用TNF-a后ATP2A3的表达量显著降低（P=0.00）。表达验证的总体结果与质谱鉴定结果一致。4.靶向ELP2的SiRNA对成骨细胞分化的影响：设计合成ELP2siRNA靶序列,将3对靶向ELP2的siRNA以及阴性对照siRNA分别转染正常C2Cl2细胞,Western Blotting检测转染后ELP2蛋白水平的改变。与对照组相比,在正常C2Cl2细胞中转染Si-ELP2-1干扰序列的ELP2siRNA后,ELP2在蛋白水平的表达量显著降低。ALP荧光活性定量分析可见,转染siRNA-NC或ELP2siRNA后成骨细胞的成骨活性差异有统计学意义（F=33922.40,P=0.00）。经多重比较显示：与对照组相比,单独应用BMP-2可显著增加成骨细胞的成骨活性（P=0.00）；与BMP-2组相比,联合应用TNF-a及siRNA-NC后可显著降低成骨细胞的成骨活性（P=0.00）, ALP活性由9.4倍降至2.8倍；与联合应用TNF-a及siRNA-NC组相比,联合应用TNF-a及ELP2siRNA后可显著增强成骨细胞的成骨活性（P=0.00）,转染ELP2siRNA能够显著对抗TNF-a抑制BMP-2-诱导的ALP活性,ALP活性恢复至5.7倍。结论1. TNF-a作为刺激物、BMP-2诱导C2Cl2肌源细胞分化为成骨细胞的炎症刺激下成骨细胞分化模型经验证有效。2.筛选得到5个炎症刺激成骨细胞分化过程中差异蛋白,即S100-A4,ATPase inhibitor （mitochondrial）, Cytochrome b5, SERCA3和ELP2。其中S100-A4,ATPase inhibitor （mitochondrial）, Cytochrome b5和ELP2在正常分化中上调,而在炎症刺激分化中下调；SERCA3在正常分化中下调,而在炎症刺激分化中表达上调。3. MRM, Western Blotting以及RT-PCR验证ELP2与SERCA3的表达趋势与iTRAQ鉴定结果一致。4.沉默ELP2表达可以改善炎症刺激对成骨细胞分化的抑制。ELP2可以作为一个理想的药物靶点改善炎症相关性成骨分化抑制疾病。