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背景：银屑病(Psoriasis)俗称牛皮癣,是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性增生性皮肤病,被称为“不死的癌症”。角质形成细胞的过度增殖是出现银屑病皮损的主要原因之一,控制表皮角质形成细胞的增殖在银屑病的临床治疗方面有重要意义。STAT3是一种重要的核转录因子,具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,参与细胞增殖、存活、转化、迁移等过程。STAT3在以表皮过度增殖和异常分化为特征的皮肤病的发病中起重要作用,是银屑病发病中重要的信号传导与转录激活因子。阻断STAT3的信号传导途径很可能成为治疗银屑病的一种有效的方法。银屑灵片是广东省中医院治疗银屑病的常规用药。以往研究表明,该方具有抑制角质形成细胞增殖、诱导凋亡的作用,对于过度增殖的角质形成细胞,银屑灵片含药血清也具有明显的抑制增殖的作用。结合该方前期研究结果,我们提出工作假设：银屑灵片抑制角质细胞的增殖可能与干预STAT3通路有关。目的：采用脂多糖LPS诱导人角质形成细胞HaCaT,造成角质细胞过度增殖模型,模拟银屑病病理状态。继而观察STAT3通路对角质细胞增殖的影响,在体外明确该信号通路与银屑病发病之间的联系；另一方面,我们采用银屑灵片含药血清,观察该药对STAT3通路的干预作用,明确药物的作用机理。该研究将为提高医院制剂的研究水平,从信号通路角度进行中医药防治银屑病的机理研究,提供实验依据。方法：1.过度增殖细胞模型的建立：取对数期生长的HaCaT细胞铺种于96孔板,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度LPS(100ng/mL、10μg/mL、30μg/mL)作用HaCa细胞不同时间(6h、12h、24h、48h)细胞的0D值,与空白对照细胞比较,观察LPS对HaCaT细胞增殖的作用,以制备过度增殖的角质细胞模型。2.银屑灵含药血清对异常增殖的角质细胞生长的影响：培养HaCaT细胞,在LPS(10μg/mL)诱导下,不同剂量(5%、10%、20%)银屑灵刺激不同时间(24h、48h)后,MTT法以及细胞活力分析仪法分析银屑灵含药血清对过度增殖(?)HaCaT细胞生长的影响。3.银屑灵含药血清对异常增殖的角质细胞凋亡的影响：采用Hochest33258染色分析银屑灵含药血清(20%)作用于过度增殖HaCaT细胞48h细胞凋亡的状况。4.银屑灵含药血清对过度增殖HaCaT细胞IL-8、TNF-a、MCP-lmRNA表达的影响：Real-time PCR法检测银屑灵含药血清(20%)作用于过度增殖HaCaT细胞48h时间点IL-8、TNF-a、MCP-1等3个基因mRNA相对表达水平。5.银屑灵含药血清对过度增殖HaCaT细胞IL-6、MCP-1、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响Western-blot分析银屑灵含药血(20%)作用于过度增殖HaCaT细胞48h后IL-6、MCP-1、STAT3和p-STAT:3蛋白相对表达水平。6.在STAT3信号通路抑制剂WP1066作用F银屑灵含药血清对相应基因和蛋白表达的影响：四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度WP1066(1μmol/L、4μmol/L、8μmol/L)作用不同时间(4h、8h、12h、24h)HaCaT细胞的增殖情况,以确认WP1066的适用浓度及适用时间。最终选取相应浓度WP1066作用4h,20%银屑灵含药血清刺激48h后,银屑灵含药血清对过度增殖HaCaT细胞生长的影响。Real一time PCR法检测IL-8、TNF-a、 MCP-1等3个基因mRNA相对表达水平。Western-blot分析IL-6、MCP-1、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达水平。结果：1LPS(10μg/mL)对HaCaT细胞有显著的刺激增殖作用,可造成人角质形成细胞HaCaT的过度增殖状况从而制备银屑病病理模型。2.MTT法和细胞活力分析结果显示：银屑灵含药血清能显著抑制过度增殖HaCaT细胞的生长,且具有剂量依赖性。3Hochest33258染色显示银屑灵含药血清(20%)作用48h后能促进过度增殖HaCaT细胞的晚期凋亡4Real-time PCR法显示银屑灵含药血清(20%)作用于异常增殖的HaCaT细胞48h能明显抑制IL-8、TNF-a、MCP-1mRNA的表达,与阳性药物阿维A相比作用更加明显。5Western-blot结果显示银屑灵含药血(20%)作用于过度增殖HaCaT细胞48h时间点,MCP-1、IL-6、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达水平显著降低。6WP1066(8μmol/L)作用4h对HaCaT细胞就有显著的抑制增殖作用。WP1066(8μmol/L)作用4h后,银屑灵含药血清(20%)作用于过度增殖HaCaT细胞48h,与LPS+20％Ctrl组相比,LPS+20％Ctrl+WP1066能显著下调IL-8、TNF-a、MCP-1mRNA的表达以及IL-6、MCP-1、STAT3和p-STAT3蛋白的表达。LPS+20％YXL+WP1066与LPS+20％Ctrl+WP1066组相比,IL-8、TNF-a、MCP-lmRNA的表达以及IL-6、MCP-1、STAT3和p-STAT3蛋白的表达进一步下调。结论：银屑灵含药血清可抑制过度增殖HaCaT细胞的增殖,促进其凋亡;其对过度增殖HaCaT细胞的抑制作用可能与抑制(?)IL-8、TNF-a、MCP-1等基因及蛋白的表达有关：银屑灵含药血清可抑制过度增殖HaCaT细胞STAT3和p-STAT3蛋白的表达：阻断STAT3言号通路可能在银屑病的治疗中发挥作用：单独使用STAT3信号通路阻断剂也可明显抑制HaCaT细胞增殖；阻断剂与银屑灵合用后,后者对相应基因及蛋白表达的抑制作用并未减弱,并且有一定增强的趋势,提示STAT3可能不是银屑灵作用的唯一信号通路。