【摘 要】
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研究背景与目的:肠道菌群失调与炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）的发病密切相关。基于调控肠道菌群的治疗手段在改变肠道微生物组成的同时,也可改善肠屏障的功能。肠上皮细胞作为肠屏障最重要的组成,其损伤修复机制一旦被破坏,将会导致疾病恶化进展。然而,关于特定菌株促进肠上皮细胞炎性损伤修复的研究鲜有报道。脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis,B.fr
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No.81770530）； 国家卫生计生委公益事业专项（No.201502026）； 广东省科技计划项目（No.2017B02029003）；
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研究背景与目的:肠道菌群失调与炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）的发病密切相关。基于调控肠道菌群的治疗手段在改变肠道微生物组成的同时,也可改善肠屏障的功能。肠上皮细胞作为肠屏障最重要的组成,其损伤修复机制一旦被破坏,将会导致疾病恶化进展。然而,关于特定菌株促进肠上皮细胞炎性损伤修复的研究鲜有报道。脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis,B.fragilis,BF）ZY-312 是从健康新生儿粪便中分离得到的一株非产毒脆弱拟杆菌株。前期工作表明,ZY-312可以改善动物肠道屏障功能,从而对包括DSS诱导的结肠炎在内的肠道疾病动物模型起保护作用。因此,本文旨在探究在DSS诱导的结肠炎中,脆弱拟杆菌ZY-312对肠上皮损伤修复的影响及其相关机制。研究方法:1.将脆弱拟杆菌ZY-312通过灌胃的方式处理DSS结肠炎小鼠,记录小鼠的体重变化情况、大便性状。小鼠眼球静脉采血并处死后,分离小鼠结肠,提取肠上皮细胞（CEC）和结肠黏膜固有层细胞（cLP）用于后续实验。2.HE染色用于评估肠道炎症,免疫组织化学染色用于检测肠道Ki67和STAT3表达情况。3.利用Cre/loxP重组系统原理方法繁育STAT3肠上皮细胞特异敲除鼠,并利用PCR、western blot和免疫组化对其进行鉴定。4.流式细胞术用于检测小鼠CEC及MC38细胞系的细胞周期分布。5.利用流式细胞术和荧光原位凋亡检测MC38细胞的凋亡情况。6.利用流式细胞分析检测小鼠cLP中细胞的表型。7.Western blot用于检测CEC及MC38中caspase-3、p-STAT3等蛋白的表达情况。8.提取小鼠骨髓来源树突细胞（BMDC）与脾脏T细胞,建立体外共培养体系。9.ELISA方法检测小鼠结肠和血浆以及细胞体外共培养上清中特定细胞因子的浓度。研究结果:1.脆弱拟杆菌ZY-312促进DSS结肠炎小鼠结肠上皮细胞的损伤修复:在DSS诱导的结肠炎小鼠中,ZY-312能够促进结肠上皮细胞增殖并抑制上皮细胞凋亡。2.脆弱拟杆菌ZY-312对DSS小鼠结肠炎的保护作用依赖于结肠上皮细胞STAT3表达:在DSS诱导的结肠炎小鼠中,ZY-312能够促进结肠上皮细胞p-STAT3表达。而在STAT3肠上皮特异敲除鼠中,ZY-312对DSS诱导的结肠炎保护作用被明显削弱。3.脆弱拟杆菌ZY-312提高结肠炎小鼠的结肠IL-6和IL-22水平:在DSS诱导的结肠炎小鼠中,ZY-312能够提高结肠匀浆和血浆中IL-6、IL-22水平;在体外,ZY-312可以加强cLP细胞分泌IL-6和IL-22的作用。4.IL-22在体外介导脆弱拟杆菌ZY-312对结肠上皮细胞STAT3表达的调控,进而促进细胞的修复作用:ZY-312与活化的cLP细胞共培养（ZY-312-LPS-cLP）所得的上清,能够激活结肠上皮细胞MC38的p-STAT3表达,抑制凋亡蛋白caspase-3激活,进而加强细胞增殖和对抗（TNF-α）凋亡的能力;封闭了ZY-312-LPS-cLP上清中的IL-22之后,MC38细胞的细胞存活能力降低。5.脆弱拟杆菌ZY-312促进结肠固有层中T细胞分泌IL-22:在DSS诱导的结肠炎小鼠中,ZY-312激活的IL-22主要来自于cLP中的CD4+RORyt+IL-22+T细胞。6.脆弱拟杆菌ZY-312调控结肠固有层CD103+树突状细胞分化:DSS诱导的结肠炎小鼠中,ZY-312促进cLP中CD103+树突状细胞分化。7.脆弱拟杆菌ZY-312在体外促进BMDC分泌IL-6:在体外,ZY-312可以激活BMDC中IL-6/JAK2/STAT3正反馈回路,进而刺激成熟BMDC分泌IL-6。8.BMDC分泌的IL-6在体外介导脆弱拟杆菌ZY-312对T细胞分泌IL-22的调控:在体外,ZY-312与成熟BMDC共培养（ZY-312-LPS-BMDC）得到的含有较多量的IL-6的上清,可以诱导cLP细胞和脾脏T细胞分泌IL-22;而封闭了上清中的IL-6后,其促IL-22的作用被削弱。在ZY-312与T细胞共培养体系中,当且仅当BMDC存在时,脾脏T细胞才能分泌大量的IL-22。研究结论:脆弱拟杆菌ZY-312通过调控IL-6/IL-22/STAT3轴,促进结肠上皮细胞损伤修复,从而对DSS诱导的小鼠结肠炎起保护作用。
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