【摘 要】
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研究背景和目的CTCF是一个多功能的转录因子,在多种癌症的发生发展过程中扮演着重要的角色,但是其在结直肠癌中的作用尚不明确。本课题拟通过检测CTCF在结直肠癌组织和细胞中的表达情况,初步分析其表达与结直肠癌的相关性,并通过一系列分子生物学实验,探究CTCF在结直肠癌发生、发展和化疗抵抗中的作用及其中涉及的分子调控机制,为结直肠癌的早诊早治提供理论基础。研究方法1.CTCF在结直肠癌组织和细胞中的表
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81772964）； 国家卫生计生委公益事业专项（No.201502026）； 广东省科技计划项目（No.2017B020209003）；
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研究背景和目的CTCF是一个多功能的转录因子,在多种癌症的发生发展过程中扮演着重要的角色,但是其在结直肠癌中的作用尚不明确。本课题拟通过检测CTCF在结直肠癌组织和细胞中的表达情况,初步分析其表达与结直肠癌的相关性,并通过一系列分子生物学实验,探究CTCF在结直肠癌发生、发展和化疗抵抗中的作用及其中涉及的分子调控机制,为结直肠癌的早诊早治提供理论基础。研究方法1.CTCF在结直肠癌组织和细胞中的表达定位（1）利用公共数据库（GEO数据库和TCGA数据库）,通过GSEA基因集富集分析的方法分析结直肠癌中CTCF表达与肿瘤相关基因集的相关性;（2）提取77对结直肠癌及癌旁正常组织的mRNA和12对结直肠癌及癌旁正常组织的蛋白质,分别通过qRT-PCR和Western blot检测CTCF在其中的表达情况;（3）提取结直肠癌细胞系mRNA和蛋白质,分别通过qRT-PCR和Western blot检测CTCF的表达量。2.CTCF在结直肠癌细胞增殖中的作用（1）构建CTCF稳定过表达细胞株,通过qRT-PCR和Western blot鉴定细胞株过表达效果,通过CCK8、平板克隆、EdU及裸鼠皮下成瘤实验检测过表达CTCF后细胞的增殖能力;（2）构建敲低CTCF的稳定细胞株,通过qRT-PCR和Western blot鉴定细胞株干扰效率,通过CCK8、平板克隆、EdU及裸鼠皮下成瘤实验检测敲低CTCF表达后细胞的增殖能力;3.CTCF调控结直肠癌细胞增殖的分子机制（1）通过Western blot检测过表达或者敲低CTCF后,Hedgehog信号通路关键信号分子的变化;（2）运用Hedgehog信号通路抑制剂GDC-0449证实CTCF通过特异性调控Hedgehog信号通路调控结直肠癌的增殖;（3）通过ChIP、双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和Western blot实验证实CTCF对P53基因的转录调控作用。4.CTCF在结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗抵抗中的作用（1）通过CCK8检测过表达或者敲低CTCF后5-氟尿嘧啶对结直肠癌细胞的增殖抑制作用,通过Western blot实验检测5-氟尿嘧啶刺激结直肠癌细胞后CTCF的表达变化;（2）通过凋亡试剂盒检测过表达或者敲低CTCF后5-氟尿嘧啶对结直肠癌细胞诱导凋亡作用的变化,通过Western blot实验检测凋亡信号通路相关标记分子的表达情况;（3）通过qRT-PCR和Western blot实验检测细胞中过表达或者敲低CTCF后药物转运蛋白家族成员ABCG2的表达情况,通过qRT-PCR实验检测结直肠癌组织中CTCF和ABCG2表达的相关性。结果1.GSEA基因富集分析结果显示,在GEO数据库（GSE17538）和TCGA数据库中,肿瘤相关基因集、结直肠癌相关基因集、增殖相关基因集、Hedgehog信号通路相关基因集等在CTCF高表达组显著富集;2.CTCF在结直肠癌组织中表达较癌旁正常组织中高;3.CCK8、平板克隆、EdU和裸鼠皮下成瘤实验表明过表达CTCF可促进结直肠癌细胞增殖,敲低CTCF可减弱结直肠癌细胞的增殖能力;4.CTCF可通过调控Hedgehog信号通路影响结直肠癌细胞的增殖能力;5.CTCF可通过转录抑制P53调控Hedgehog信号通路;6.过表达CTCF可降低化疗药物5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用,敲低CTCF后可促进化疗药物5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用;7.qRT-PCR和Western blot实验表明CTCF可正向调控ABCG2的表达。结论CTCF在结直肠癌组织和细胞中相对高表达,可以通过P53-Hedgehog信号通路轴增强结直肠癌细胞的增殖能力和对化疗药物5-氟尿嘧啶的抵抗作用。
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