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目的:肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种病因未明神经系统变性病,选择性损伤大脑皮层运动神经元、脑干运动神经核神经元、脊髓前角a运动神经元,导致进行性加重的肌肉无力、萎缩,最终因呼吸肌麻痹死亡。近年来研究发现部分ALS患者存在自主神经系统、锥体外系系统、感觉系统等非运动神经区域受累的症状,提示ALS可能是一个多系统累及的神经变性疾病。Murata Y发现ALS伴发昼夜血压的变化,血压与心率之间的相关性的降低,严重可诱发循环衰竭、心律失常乃至猝死[1];及其他自主神经异常的表现如:排汗增加及减少[2]、唾液分泌减少[3]、胃排空时间延长[4]等改变。Takahashi H及Kennedy PG分别报道ALS患者胸髓中间外侧核神经元的丢失[5-6],Itoh T发现神经元免疫活性的改变[7]及Kihira T也在萎缩神经元胞浆内发现了包涵体[8],比如Onuf,s核的bunnia小体。在SOD1(V118L)基因突变的家族型ALS患者短期内出现自主神经衰竭,尸检发现延髓自主神经核及中间外侧柱明显的神经元丢失[9]。对SOD1G93A转基因小鼠研究发现安静状态下早期转基因鼠心率增高,提示疾病早期自主神经功能损伤[10]。交感神经的低级中枢位于脊髓胸1(T1)至腰2-腰3(L2或L3),组成了中间外侧柱(IML),在调节自主神经功能方面具有重要作用。本实验拟应用甲苯胺蓝染色及免疫组化的方法,观察家族型肌萎缩侧索硬化动物模型(SOD1G93A转基因小鼠)病程不同阶段脊髓侧角神经元的结构及乙酰胆碱酯酶的表达情况,旨在探讨脊髓侧角神经元在ALS的发病过程的变化特征,为ALS发病机制研究提供一定的理论基础。方法:1模型建立及分组饲养繁殖家族型肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1G93A转基因小鼠,参考Vercelli A[11]等的1-5分评分法进行评分,4分为发病时间,1分为死亡时间,60天为症状前期,4分为症状早期,1分为终末期。各对照组为同窝、同月龄未转人突变的SOD1基因的小鼠。每组各3只小鼠。2取材10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,心脏灌注4%多聚甲醛固定20min,取小鼠脊髓胸段将其分成上段(T1-T3)、中段(T4-T6)、下段(T7-T9),分别以4%多聚甲醛固定48h。3甲苯胺蓝染色后固定的组织块经梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,连续组织切5μm片,进行甲苯胺蓝染色。依据Oppenheimer定量组织学方法[12],计数脊髓侧角神经元。4免疫组化染色10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,心脏灌注4%多聚甲醛固定30min,取小鼠脊髓胸段将其分成上胸髓(T1-T3)、中胸髓(T4-T6)、下胸髓(T7-T9),分别以4%多聚甲醛固定12小时,震荡切片25μm厚,应用乙酰胆碱酯酶进行免疫组化染色。5统计学处理采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。采用均数±标准差表示上段(T1-T3)、中段(T4-T6)、下段(T7-T9)各脊髓切片两侧神经元计数之和,三组数据的比较采用单因素方差分析,两组数据的比较采用两个独立样本比较的t检验,以a=0.05为显著性检验标准。结果:1模型建立B6SJL-BTg(SOD1G93A)1Gur/J半合子雄鼠与B6SJLF1/J+/+雌鼠1:1杂交,在恒温、恒湿、12h光照/黑暗交替循环、无特殊病原菌的(Specificpathogen free, SPF)环境中,喂以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料及灭菌水,经剪尾尖提取DNA、PCR扩增后、琼脂糖凝胶电泳结果示(Fig.1):位于200-300bp之间的条带(236bp)为mSOD1的PCR产物,此种小鼠为SOD1G93A转基因阳性小鼠。没有此条带为非mSOD1的PCR产物,为非SOD1G93A转基因鼠。2甲苯胺蓝染色2.1上胸髓(T1-T3)症状前期、发病期、终末期SOD1G93A转基因小鼠中神经元计数分别为7.4±3.0、7.0±2.0、3.7±1.5,对照组分别为5.3±1.9、4.1±1.2、6.1±1.9,症状前期和发病期期较终末期比较均有显著性差别(P<0.05)。发病期及终末期神经元计数较对照组有显著性差别(P<0.05)。症状前期及发病期转基因鼠神经元大致正常,终末期神经元变性。2.2中胸髓(T4-T6)SOD1G93A转基因小鼠症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为4.5±1.6、4.3±1.5、2.5±1.2,总体均数比较P=0.01(>0.05)差别无显著性意义。对照组分别为4.1±2.0、4.5±2.0、5.5±1.6,终末期SOD1G93A转基因小鼠神经元细胞计数较对照组有显著性差别(P<0.05)。症状前期及发病期转基因鼠神经元大致正常,终末期神经元变性。2.3下胸髓(T7-T9)SOD1G93A转基因小鼠在症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为4.4±1.6、5.0±1.8、2.4±0.8,对照组分别为5.0±2.0、4.4±1.2、5.5±1.6,症状前期和发病期较终末期比较均有显著性差别(P<0.05)。终末期SOD1G93A转基因小鼠神经元细胞计数较对照组有显著性差别(P<0.05)。症状前期及发病期转基因鼠神经元大致正常,终末期神经元变性。3免疫组化染色3.1上胸髓(T1-T3)SOD1G93A转基因小鼠症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为6.5±1.2、6.0±2.0、3.7±1.2,对照组分别为5.8±1.9、7.8±1.5、5.0±1.0,症状前期和发病期较终末期比较均有差别(P<0.05)。发病期神经元细胞计数较对照组有显著性差别(P<0.05)。症状前期及发病期神经元包浆呈深褐色,胞核无色,成多边形。终末期神经元变性,着色变淡。3.2中胸髓(T4-T6)SOD1G93A转基因小鼠症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为6.6±2.6、4.9±2.0、3.0±1.4,症状前期和发病期与终末比较均有差别(P<0.05)。对照组分别为4.8±1.0、5.5±0.6、5.8±1.0,终末期神经元细胞计数较对照组有显著性差别(P<0.05)。症状前期及发病期神经元包浆呈深褐色,胞核无色,成多边形。终末期神经元变性,着色变淡。3.3下胸髓(T7-T9)SOD1G93A转基因小鼠症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为6.7±1.8、6.3±2.6、3.0±1.0,总体均数比较P=0.059(>0.05)差别无显著性意义,对照组分别为5.3±1.2、5.3±1.5、5.0±0.0,终末期神经元细胞计数较对照组有显著性差别(P<0.05)。症状前期及发病期神经元包浆呈深褐色,胞核无色,成多边形。终末期神经元变性,着色变淡。结论:在SOD1转基因鼠发病过程中,存在脊髓侧角神经元丢失,尤其是在疾病的终末期,上、中、下胸髓节段间无明显差异。