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目的:观察不同浓度、不同时间β-淀粉样肽40(amyloid-β40,Aβ40)诱导的内皮损伤过程中糖基化终末产物受体( receptor for advanced glycation end-products,RAGE)和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的表达情况,探讨Aβ40对内皮细胞损伤的程度及其机制。方法:1.培养人脐静脉内皮细胞株(human umbilical endothelium cells, ECV-304),建立Aβ40诱导的内皮细胞损伤模型。2. Aβ40诱导ECV-304细胞损伤30min、3h、3d后,倒置显微镜观察形态学变化;四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测3d时Aβ40(0.005μM、0.05μM、0.5μM、5μM、50μM)作用细胞的增殖情况,并从中筛选出最适损伤浓度。3.留取30min、3h以及3d细胞培养上清液,比色法测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、硫代巴比妥酸法测定丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)以及硝酸还原酶法测定一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量。4.采用逆转录聚合酶链反应( Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测各时间点Aβ40介导的内皮细胞损伤过程中RAGE mRNA水平的表达情况。5.免疫细胞化学方法检测各时间点Aβ40诱导的内皮细胞损伤过程中NF-κB的表达情况。结果:1.细胞形态学:30min及3h无明显变化,3d时50μM Aβ40与细胞孵育后,细胞胞体肿胀,胞浆空泡化,细胞排列紊乱数量减少,其他浓度无明显变化,仍可见ECV-304细胞呈单层铺路石状紧密排列。2. 3d时细胞生存率(%),筛选Aβ40损伤内皮的适宜浓度:0.05μM组(81.99±9.01)和0.5μM组(80.86±9.60)与0.005μM组(91.19±4.66)比较差异均无统计学意义(P>0.05);5μM组(73.33±1.56)与0.005μM组比较细胞生存率明显下降(P<0.01);50μM组(25.39±3.11)与其他各组比较细胞生存率均显著下降(P<0.001),但生存率过低,故本研究选用0.5μM和5μM用于损伤效应评定。3. LDH活力(U/L):30min时对照组、0.5μM组以及5μM组LDH活力分别为1226.9±248.6、1320.2±109.6、1458.6±232.6,3h时各组LDH活分别为1203.3±378.4、1306.2±248.3、1533.3±138.1,各组比较无统计学差异(P>0.05);3d时5μM组(1576.0±457.1)与对照组(1184.3±118.3)比较明显增高(P<0.05),0.5μM组(1291.8±193.6)与对照组比较差异无统计学意义( P>0.05) , 5μM组与0.5μM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4. MDA浓度(μM ) : 30min时0.5μM组( 3.79±0.06 )和5μM组(3.95±0.08)与对照组(3.30±0.12)比较显著升高(P<0.01,P<0.001),5μM组与0.5μM组比较差异无统计学意义( P>0.05 ) ; 3h时0.5μM组(4.16±0.12)和5μM组(4.77±0.12)与对照组(3.18±0.12)比较均显著升高(P<0.001),5μM组与0.5μM组比较显著升高(P<0.01);3d时0.5μM组(4.28±0.18)和5μM组(5.32±0.12)与对照组(3.67±0.18)比较显著升高(P<0.01,P<0.001),5μM组与0.5μM组比较显著升高(P<0.001)。5. NO的含量(μM) : 30min时0.5μM组( 57.39±5.06)与对照组(56.16±6.56)比较差异无统计学意义(P>0.05),5μM组(62.62±6.39)明显高于对照组( P<0.05) ; 3h时0.5μM组( 68.20±8.38)和5μM组(79.00±19.99)与对照组(51.62±9.01)比较明显升高(P<0.05,P<0.01);30min和3h时5μM组与0.5μM组比较差异无统计学意义(P>0.05),3d时0.5μM组(75.81±14.82)与对照组(65.87±6.76)比较差异无统计学意义(P>0.05),5μM组(100.04±30.18)与对照组、0.5μM组比较明显升高(P<0.01,P<0.05)。6. RAGE mRNA的表达:30min时0.5μM组(0.35±0.04)和对照组(0.40±0.05)比较差异无统计学意义(P>0.05),5μM组(0.54±0.04)与对照组比较明显增强(P<0.001);3h时0.5μM组(0.59±0.04)与5μM组(0.82±0.08)均显著高于对照组(0.41±0.03)(P<0.001);3d时0.5μM组(0.89±0.09)和对照组(0.70±0.13)比较差异无统计学意义(P>0.05),5μM组(1.50±0.20)显著高于对照组(P<0.001)。各时间点5μM组较0.5μM组均明显增强(P<0.001),呈一定的浓度依赖性。7. NF-κB的表达率(%):30min时0.5μM组(4.45±0.16)和5μM组(5.25±0.66)均显著高于对照组(2.37±0.91)(P<0.001),5μM组与0.5μM组比较差异无统计学意义(P>0.05);3h时0.5μM组(17.10±0.85)与5μM组(19.58±0.62)均显著高于对照组(7.61±0.23)(P<0.001),5μM组与0.5μM组比较明显升高(P<0.001);3d时0.5μM组(9.03±1.05)与对照组(8.52±0.79)差异无统计学意义(P>0.05),5μM组(13.47±1.07)与对照组比较及与0.5μM组比较均明显升高(P<0.001)。结论:1. Aβ40在各时间点均能损伤内皮细胞,表现在细胞生存率降低、LDH释放增多、MDA生成增加以及NO合成增加,呈一定浓度及时间依赖性的氧化应激损伤。2. Aβ40损伤内皮的同时伴有RAGE及NF-κB的表达上调,并呈一定的浓度及时间依赖性。说明Aβ40、RAGE及NF-κB的相互作用对内皮损伤具有重要影响,阻断其中的某个环节都可能发挥内皮保护作用。