目的：评价腺病毒介导骨形态蛋白—7基因对绝经期骨质疏松的抑制作用和对去势大鼠骨质疏松椎体的骨形成作用，探索用BMP-7基因转染的方法治疗绝经期的骨质疏松及生物性的椎体成型术的可行性。背景：绝经后的骨质疏松症是因为雌激素的缺乏导致的骨丢失造成的，虽然其确切的生物学机制还不清楚，但已经有很多证据证明，它是因骨转换周期增强所致，也就是骨吸收大于骨形成所致。其中成骨细胞和破骨细胞的相互耦联及各种生物因子对成骨细胞和破骨细胞的刺激及抑制作用对骨质疏松的形成和发展起着至关重要的作用。因此人们想到用各种生物因子来治疗骨质丢失性疾病，主要是采用针对骨吸收、骨形成或同时作用于两者的生物因子。但局部应用生物因子有很大的局限性，主要是在载体、作用时限和局部浓度方面不易达到持续治疗的目的，同时生物性的载体在生物相容性方面尚不理想，如存在免疫排斥反应等。同时骨质疏松是一种全身性的代谢性疾病，直接的生物因子的局部应用在一般的情况下不能达到全身的治疗作用，因此有必要探索一种能使这些治疗蛋白持久释放的方法来解决这一问题，目前，较为理想的方法是基因转染的方法。因为它在携带生物因子，产生足够浓度的生物因子和达到持久的较高的治疗浓度上都较为符合条件，基因治疗的方法可能对骨质疏松的治疗带来希望。方法：(1)从人骨肉瘤细胞株U-OS抽取总RNA，一步法RT-PCR获得hBMP-7的cDNA片断，插入穿梭质粒pTrack-CMV，在大肠杆菌内与pAdEasy-1实现同源重组，阳性克隆转染293细胞，扩增纯化得到大量病毒上清，纯化后Western blot检测hBMP-7表达情况。(2)采用去势大鼠做为绝经期骨质疏松的动物模型，并通过去势前后椎体组织学及骨组织形态计量学的检测证明动物模型制备成功。(3)本实验首先评价了腺病毒介导骨形态蛋白-7基因转染对去势大鼠骨质疏松的抑制作用。即在去势后1周将腺病毒介导的骨形态蛋白-7基因通过椎体髓腔注射的方法转移至大鼠椎体内，荧光蛋白标记基因用来检测椎体内细胞的感染情况；骨干重测量来检测全身骨丢失的情况；骨组织形态学观察椎体骨小梁骨质疏松的情况；骨形态定量方法评价椎体骨小梁的动静态指标的变化情况。(4)然后采用同体对照的方法，在去势后3个月的已形成骨质疏松的大鼠椎体中注入纯化的腺病毒BMP-7来观察腺病毒BMP-7对骨质疏松椎体的骨形成的促进作用，同样以椎体髓腔细胞的荧光标记来检测BMP-7在椎体中的分第二军医大学博士论文·摘要泌及感染椎体细胞的情况，用组织学及态计量学的方法检测骨形成的情况。结果:(l)在造模实验中，骨组织形态学结果显示:大鼠去势术后30天开始假手术组及去势组大鼠出现骨质疏松，而正常对照组则骨质正常，术后120天假手术组大鼠骨质疏松不明显，去势组大鼠骨质疏松在3个月内渐进性加重，对照组骨质无明显变化。骨形态计量学结果.显示:假手术组和对照组在3个月时与术前相比，各种动静态指标都无明显变化，去势组的各指标表现出一种骨转换周期增强导致骨丢失的改变，说明骨质疏松动物模型已制备成功;(2)在基因构建及转染方面，首先从人骨肉瘤细胞中成功分离出纵P一7基因片断，检测与基因库中基因片断相同，将孙P一7基因片段与腺病毒实现同源重组，在大肠杆菌中表达后转染入人胚肾细胞进行扩增表达，检测表达产物的活性和滴度证明该方法成功构建了腺病毒故P一7并且可高效表达(测定滴度为10与;(幻在腺病毒介导骨形态蛋白一7基因转染对去势大鼠骨质疏松的抑制作用的实验中，将高效表达产物 Ad分淤一7注入骨质疏松推体后一周，取出椎体冲洗髓腔进行荧光观察发现髓腔细胞中有标记荧光，说明携带BMP一7的腺病毒转入后成功感染椎体内细胞，并能分泌B班)一7因子，荧光素蛋白的活性持续了最少3周。术后1月的骨干重的测量显示注入AdB期队7组的动物骨量明显大于其余各组;骨形态学检测结果显示注入规BMP一7的椎体骨小梁结构较完整，而其余各组的骨小梁变细、断裂。5周后用骨形态定量进行检测显示为形MP一7基因注入的椎体的各项动静态指标都明显优于其余各组椎体:(4)在腺病毒BMP一7对骨质疏松推体的骨形成的促进作用的实验中，术后1周，注射AdBM扒7的骨质疏松椎体的髓腔冲洗液中可以着到标记荧光。术后1月，组织形态学方面，AdB入矽一7注射椎体的骨小梁在分布及粗细_上与其余各组明显不同，植入AdBMP一7的椎体的骨小梁比较完整，而其他对照椎体骨小梁为明显的骨质疏松的表现，有断裂，变细，盲端等。与无骨质疏松的正常对照组相比，术后1月的AdBMP一7植入椎体的骨小梁不如未去势鼠的推体。骨形态定量方面的各项指标中，类骨质平均厚度、骨吸收表面、矿化沉积率等参数在从BMP·7注入组椎体的终板下区中较其他各组无显著差异，平均骨小梁厚度，骨形成表面，骨小梁体积百分数较量各对照组椎体增高，各组与未去势大鼠椎体有显著差异，各项动静态指标不如未去势大鼠推体。结论:(1)AdEasy踢Vector System容易构建，感染率高，可快速高效大量表达蛋白质，是第二军医大学博士论文·摘要进行基因治疗可考虑的有效载体