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目的:本实验对miR-145进行靶基因预测并验证,通过体内外实验观察miR-145对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠Th17细胞分化及其介导体液免疫应答的影响,以揭示miR-145在EAMG发病机制中的作用,为MG的治疗开辟新途径。 方法:1.用TargetScan靶基因预测软件对miR-145的靶基因进行预测并进行荧光素酶活性分析进一步验证。2.体外实验:采用CFA+R97-116肽段免疫Lewis大鼠,第14天处死大鼠,取脾分离单核细胞,并进一步经免疫磁珠(MACS)分选CD4+T细胞,将细胞分为空白组、实验组和对照组,实验组与对照组分别转染pre-miR-145及pre-miR-control,于转染后第48h收集一部分细胞分析转染效率,Q-PCR分析miR-145表达,Westren Blot检测NFATc1蛋白表达。将另一部分转染后的CD4+T细胞继续与纯化的DC细胞以3∶1比例共培养,于共培养的第96h经ELISA检测IL-17浓度,流式检测CD4+IL-17+细胞表达。3.体内实验:构建miR-145慢病毒载体,进行miR-145慢病毒包装及其滴度测定。构建EAMG模型,随机相匹配地分为CFA组(即空白组)和EAMG模型组(实验组,对照组)。依照Lennon评分标准,利用双盲法对两组鼠每天进行体重测量和行为学观察。在第二次免疫当天,实验组将Lenti-miRNA-145经尾静脉注射给大鼠,对照组给予Lenti-miRNA-control,隔日继续进行评估,绘制体重及评分变化曲线。一部分于病毒注射30天后Q-PCR检测各个免疫器官(包括脾脏、外周淋巴结、胸腺)中miR-145的表达。另一部分大鼠分别于第二次免疫后第14、28、36天通过ELISA检测大鼠外周血抗AChR IgG表达。于病毒注射后第36天处死大鼠取脾,其中一部分脾细胞提蛋白经Western Blot检测NFATc1蛋白表达,另一部分经完全培养基培养48h后收集细胞经流式细胞仪检测CD4+IL-17+T细胞表达。 本研究测定值用均数±标准差((x)±s)表示。成组设计的多样本均数间的比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),多组之间两两比较用最小显著差数法(leastsignificant difference,LSD);两样本均数间的比较用独立样本t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。应用SPSS13.0统计软件对所以数据进行统计分析。 结果:1.生物信息学分析结果:NFATc1是miR-145的一个新的与免疫相关的靶基因。荧光素酶检测结果:与miR-control和pisCHECK2-NFATc1共转染组相比,miR-145和pisCHECK2-NFATc1共转染组荧光素酶活性显著减低;pisCHECK2-NFATc1突变体为4个连续碱基突变而来,miR-control和pisCHECK2-NFATc1突变体共转染组与miR-145和pisCHECK2-NFATc1突变体共转染组荧光素酶活性无差异。2.体外实验结果:Q-PCR结果显示miR-145在实验组中表达显著升高,Western Blot结果显示实验组NFATc1的表达显著下降;DC-T共培养实验中,ELISA检测结果显示pre-miR-145转染组IL-17水平下降,流式检测结果显示pre-miR-145转染组CD4+IL-17+T细胞比例显著降低。3.体内实验结果:测序结果证明慢病毒载体构建及包装成功。Q-PCR结果显示miR-145在实验组中脾脏及淋巴结中表达显著升高,在胸腺中表达升高不明显。体内注射慢病毒36天时Western Blot结果显示NFATc1在实验组表达显著下降(P<0.01),ELISA结果显示实验组IL-17的表达显著降低,流式检测结果亦显示实验组CD4+IL-17+T细胞比例显著下降(P<0.01)。临床评分及体重曲线均显示实验组EAMG大鼠肌无力症状改善。 ELISA检测结果显示第28天、36天时实验组抗AChR IgG的分泌下降。 结论:通过靶基因预测软件预测并经荧光素酶报告基因检测证实NFATc1为miR-145的一个新的与免疫相关的靶基因。体内外实验结果均表明过表达的miR-145可能通过抑制NFATc1从而减少Th17表达来改善临床症状,抑制致病性自身抗体抗AChR IgG的分泌。miR-145可能作为一个潜在的治疗靶点,对人类MG的基因治疗具有重大的意义。