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随着Bt转基因作物的广泛种植,一些昆虫在田间条件下对Bt杀虫蛋白产生了抗性。Bt基因堆叠策略指将两个或两个以上Bt基因同时转入植物中表达。它一方面能延缓昆虫抗性,另一方面提高转基因作物杀虫活性,扩大作物杀虫谱。本文先使用基因连接法将Cry1Ac杀虫基因、Cry1Ig杀虫基因(223)和5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抗草甘膦基因(1174)表达框连接并插入T-DNA中,然后使用农杆菌介导法转化水稻。从获得的转化株中筛选到Cry1Ac和223高水平表达且单拷贝插入转化株。最后进一步从后代植株中筛选到纯合子转基因株。纯合子转化株高水平表达Cry1Ac、223和1174基因；对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、二化螟(Chilo suppressalis)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)有很好的抗性；对草甘膦也有高水平的抗性。但在基因连接法的实验中发现基因间表达水平差异很大,不利于多基因高表达植株的筛选。且由于T-DNA容量限制无法转入更多的基因。为了克服这些缺点,我们尝试使用2A策略(2Apolycistronic transgene)在水稻中协同表达不同Bt蛋白。2A策略是多顺反子转基因的一个重要的方法。不同基因通过2A编码序列连接(2A上游基因终止密码子删除)并在真核环境中表达时,可以通过融合基因长mRNA表达出不同的单体蛋白。由于不同基因共用一个启动子与终止子,减少了插入序列的大小,同时避免了基因启动子间的同源沉默。本文选用手足口病病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)2A肽段(F2A)和猪捷申病毒(Porcine Teschovirus, PTV)2A肽段(P2A)表达CrylAb和Cry2Ab,设计了两个T-DNA载体1300-Ubi-CrylAbF2ACry2Ab-35Sints-1174(1F2A)和1300-Ubi-Cry1AbP2ACry2Ab-35Sints-1174(1P2A)。同时由于2A上游蛋白C端序列会影响2A的切割效率,于是改变Cry1Ab和Cry2Ab在融合基因上下游的位置,设计了另外两个T-DNA载体1300-Ubi-Cry2AbF2ACry1Ab-35Sints-1174(2F2A)和1300-Ubi-Cry2AbP2ACry1Ab-35Sints-1174(2P2A)。将这四个载体使用农杆菌介导法转入水稻中。对不同T-DNA转基因水稻检测发现2A策略能用于转基因水稻中高水平协同表达Cry1Ab和Cry2Ab杀虫蛋白。根、茎和叶组织Western Blot检测发现,在水稻不同的组织中也能通过2A肽段实现CrylAb和Cry2Ab高水平协同表达。害虫生物测定发现各T-DNA转化子对棉铃虫、二化螟、斜纹夜蛾和稻纵卷叶螟有很好的抗性。另外为了比较不同2A肽段的切割效率及不同上游蛋白对2A肽段活性的影响,对不同T-DNA转化株Cry1Ab和Cry2Ab蛋白进行定量并分析切割效率。最终发现F2A的切割效率高于P2A,同时Cry1Ab在上游时,2A肽段的效率较高。Cry1Ab和Cry2Ab定量结果同时表明使用2A策略,Cry1Ab和Cry2Ab表达水平与单顺反子转基因(monocistronic transgene)表达水平相当。本文一方面通过传统基因连接法表达Cry1Ac和223杀虫蛋白基因及1174草甘膦抗性基因,最终获得Cry1Ac、223和1174基因高水平表达,单拷贝插入的纯合子转化株。此转化株具有很好的杀虫活性及高水平草甘膦抗性,有转基因商业化种植的潜力。另一方面,针对基因连接法基因间表达水平不同及T-DNA容量有限的问题,本文使用2A策略在水稻中表达Cry1Ab和Cry2Ab。最终证明2A策略可以高水平协同表达不同Bt蛋白同时降低T-DNA大小。在实验使用的四个载体中,1F2A是水稻中表达Cry1Ab和Cry2Ab最佳构建模式。