论文部分内容阅读
线虫是后生动物中种类丰富的动物之一。由于线虫的结构简单,一些线虫已被用作神经和进化研究的模型生物,如秀丽隐杆线虫。然而,在线虫类中,有一类感染动物的线虫,又称寄生线虫,给农业生产和人类健康带来了极大的危害。据WHO报道,全球约八分之一的人感染有寄生性线虫,而粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)正是其中一种。由粪类圆线虫引起的疾病称为粪类圆线虫病,是一种广泛存在却易被忽视的热带疾病(Neglected Tropical Diseases,NTD),主要在非洲等卫生条件落后的地区流行。到目前为止尚且没有简单快捷的诊断手段,也没有疫苗可用于预防粪类圆线虫病。虾青素金属蛋白酶是一种广泛存在于多种动植物体内的金属蛋白酶,研究表明该蛋白酶在寄生线虫的入侵和生长发育过程中发挥重要作用,有望成为新的检测和制备疫苗的靶位点。本项目首先通过分析粪类圆线虫在各个时期的转录组数据并从中筛选出假定为虾青素金属蛋白酶的蛋白,再通过与已经报道过的金属蛋白酶进行氨基酸序列比对来选定所要研究的基因,最后选定粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶Ss-ast-1作为研究对象。本项目以原核表达的方式体外重组表达了该蛋白,并对该蛋白酶的活性进行了探究,此外又通过显微注射的方法对Ss-ast-1的表达特征进行了探究。(1)选定粪类圆线虫Ss-ast-1作为目标基因由粪类圆线虫的全转录组数据中可以得到49个标注为金属蛋白酶的基因,将这些金属蛋白酶与之前在线虫中已报道过的虾青素金属蛋白酶放在一起构建进化树的方式对49个金属蛋白酶进行筛选,最终选定Ss-ast-1作为研究目标。(2)粪类圆线虫Ss-ast-1金属蛋白酶基因序列和氨基酸序列的结构分析Ss-ast-1的c DNA序列是从Wormbase Parasite上得到,其中编码区为1905bp,编码634个氨基酸。通过分析可知,前32个氨基酸为信号肽,氨基酸序列比对发现虾青素金属蛋白酶Ss-AST-1具有保守的功能结构域,比如Zine-binding、Met-turn、EGF-like domain等,同时对Ss-AST-1进行三维同源建模分析。预测的Ss-ast-1启动子的全长为468 bp,具有多种真核生物保守的启动子调控元件。(3)粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属的转录水平和定位分析通过转录组分析发现,该基因在粪类圆线虫的各个发育阶段均有表达,在i L3期的表达水平最高。通过显微注射,可以得到荧光虫卵,该蛋白虫卵细胞的细胞核和细胞质均有表达。(4)原核表达粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白体外原核表达并从包涵体中纯化Ss-AST-1,纯化的蛋白一部分用于酶活性实验,一部分用于制备多克隆抗体,Western blot分析表明多克隆抗体可以较好的识别全虫蛋白中的Ss-AST-1,表明该蛋白具有良好的免疫原性。本研究首次对粪类圆线虫Ss-ast-1的基因结构和功能进行了初步研究,证明Ss-ast-1在虫卵中表达,并具有良好的免疫原性,为之后开发疫苗和新的检测手段提供了一定的理论基础。