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神经细胞分化是一个复杂的过程,分化的各个阶段中都有特异的基因选择性表达。在这一过程中表观遗传调控(epigenetic regulation)发挥着重要作用。Sir2 (Silent information regulator 2)家族是一组从古细菌到高等真核生物都非常保守的烟酰胺腺苷双核酸依赖的去乙酰化酶(NAD-dependantdeacetylase),属于第三类组蛋白去乙酰化酶(HDAC),哺乳动物中有7个成员SIRT1～7[1],其中SirT7的功能尚不明确。本论文研究了SirT7的转录调控和表达情况,并以全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA,简称RA)诱导小鼠胚胎瘤(embryonal carcinoma, EC)P19细胞作为神经分化的模型,探讨了SirT7在此过程中对神经细胞分化过程关键调控蛋白Mash1的作用机制。1.RA诱导P19细胞神经分化模型的建立及SirT7表达的检测以RA诱导培养P19细胞4天后,将细胞重新置于正常培养基中培养,细胞开始有神经元分化的趋势,逐渐呈现出类似于神经元的形态,并形成稀疏的网络。以神经分化的标志蛋白神经元特异的第三类β微管蛋白(neuron specific classⅢβ-tubulin,TuJ1)进行Western免疫印迹检测发现,与正常培养的P19细胞相比,RA诱导后细胞中高表达TuJ1,反映出其神经细胞的特征。以定量RT-PCR检测发现SirT7 mRNA在RA诱导2天后表达水平开始增加,第4天时增加明显,蛋白表达与mRNA水平呈现一致的变化趋势。2.首次报道SirT7体内存在两个转录本V1和V2Western试验提示SirT7体内存在两个转录本,进一步通过启动子活性试验分析发现,两个转录本的启动子区同样具有转录活性。5’-RACE试验证明,在小鼠肝脏细胞中SirT7存在两个转录本Variant 1和Variant 2,分别简写为V1和V2。免疫荧光的方法检测到V1主要分布在核仁,而V2主要分布在细胞核与胞质中。3.RA诱导过程中SirT7 V2可促进Mash1的表达碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)家族转录因子在神经细胞分化命运中起决定作用。其中neurogenin 1 (ngn1)和Mash1是其中两个较为重要的蛋白。因此我们重点研究在RA诱导P19细胞向神经元分化过程中,SirT7 V2对ngn1和Mashl表达的影响上。利用双荧光报告系统,我们检测了SirT7 V2对ngnl和Mash1启动子活性的影响,发现SirT7 V2可明显促进Mashl启动子活性。SirT7 V2可促进神经元标志基因Mashl的mRNA和蛋白的表达,而V1没有此现象。4.SirT7 V2可促进Akt-pT308位点的磷酸化水平PI3K／Akt通路在细胞活动中参与多种过程,它在神经细胞分化过程中作用可能是多方面的。有报道称,它的激活对维持干细胞的多能性具有非常重要的意义。另外,在脑缺血损伤的模型中,激活PI3K／Akt／Erk通路可明显促进缺血区神经元的发生、迁移和神经元的分化过程。为研究SirT7 V2在P19神经分化过程中的作用机制,我们进行了多种尝试,在对主要信号通路的影响研究过程中发现,SirT7 V2可明显促进Akt-pT308位点的磷酸化水平,而对pS473位点的磷酸化水平影响不大。试验结果将SirT7 V2与PI3K／Akt通路联系起来,表明SirT7 V2可通过影响Akt-pT308位点的磷酸化水平参与神经细胞分化的过程。5.SirT7 V2可与PPlc相互作用为寻找SirT7 V2在PI3K／Akt通路中所处的位置,我们建立了稳定表达SirT7 V2的P19细胞系,利用TAP-质谱联用技术检测与SirT7 V2相互作用的蛋白。研究发现,SirT7 V2可与PPlc结合。IP试验验证了结果的可靠性。PP1属于丝／苏氨酸磷酸酶家族,PPl的细胞定位较为广泛,参与多种细胞生物过程,如：有丝分裂、凋亡、蛋白合成、细胞骨架重建和膜受体和信号通路的调节等[2]。SirT7 V2可能通过与PPlc的相互作用影响PI3K／Akt通路的信号传递,从而影响神经细胞分化过程。6.SirT7 V2可抑制PPlc对Akt-pT308位点的磷酸化作用通过转染不同剂量的PPlc和相同剂量的SirT7,我们观察到,SirT7 V2可抑制PPlc对Akt-pT308位点的去磷酸化过程,这为SirT7 V2对Akt的影响机制提供了较好的证据,也为阐明SirT7 V2在神经细胞分化过程中的作用提供了线索。SirT7是Sir2家族成员中受关注较少的一个,本文首次报道了SirT7存在两个选择性剪切体,并研究了在RA诱导P19细胞神经分化过程中SirT7 V2促进神经细胞分化的作用机制,不仅对SirT7的功能是一个重要的补充,也为进一步揭示神经细胞分化的表观遗传调控机制提供了依据,并为治疗神经性疾病提供新的线索。