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花生过敏引起的致死率占了食物过敏致死病例的59%,是人类健康的重大威胁之一。近年来研究显示欧美人群的花生过敏患病率较高,可能与他们偏爱食用由烘烤花生原料制成的花生酱有关。花生的不同加工条件如烘烤,可能改变了花生过敏原结构,并可能对花生的致敏性产生影响。本文以烘烤花生为材料,分析了烘烤温度和烘烤时长对花生蛋白含量和糖基化程度的改变;应用BALB/c小鼠模型评价了不同烘烤处理对花生致敏性的影响。在此基础上,纯化得到花生主要过敏原之一的Ara h 3蛋白,通过Caco-2细胞模型和树突状细胞模型,研究了在过敏反应的致敏阶段,烘烤对Ara h 3在肠道免疫系统中的作用,揭示了烘烤花生Ara h 3的增敏机理。主要研究内容和结论如下:1不同烘烤条件对花生蛋白含量、糖基化和致敏性的影响分别将花生仁在110℃、130℃、150℃或170℃下烘烤20 min,或置于150℃的烤箱中烘烤10 min、20 min、30 min和40 min,烘烤后提取花生蛋白,检测烘烤花生蛋白的浓度及糖基化水平。随花生的烘烤温度升高或烘烤时长增加,蛋白浓度逐渐降低;与生花生蛋白相比,无论是不同温度烘烤花生20 min,还是150℃烘烤花生不同时长,烘烤后花生蛋白中游离氨基含量显著降低,结合糖含量上升,伴有果糖胺和小分子荧光产物产生,表明花生在不同烘烤条件下,蛋白均发生了不同程度的糖基化反应。将不同烘烤花生研磨成匀浆,通过灌胃致敏BALB/c小鼠。结果显示,与生花生致敏组小鼠相比,烘烤花生致敏组小鼠的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒程度加深,空肠和肺组织炎性浸润和充血现象严重,小肠和肺组织中TSLP基因表达水平上调,小鼠血清中Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)含量升高,伴随着特异性抗体(Ig E、Ig G)和组胺含量的升高,并且烘烤花生蛋白与花生特异性Ig E抗体的结合力升高,这些结果都表明,随着花生烘烤温度升高或烘烤时长增加,其致敏性逐渐增强。2花生Ara h 3的纯化及烘烤对Ara h 3结构、糖基化和致敏性的影响通过阴离子交换色谱法分别纯化得到生花生Ara h 3蛋白(命名为Ara h 3-Raw),烘烤花生Ara h 3蛋白(命名为Ara h 3-Roasted,150℃烘烤20 min)。微观结构检测结果表明,与Ara h 3-Raw相比,Ara h 3-Roasted二级结构由有序变得无序,疏水性减小,有聚集发生。糖基化水平结果显示,与Ara h 3-Raw相比,Ara h 3-Roasted美拉德反应达到晚期。竞争抑制ELISA结果表明,烘烤处理增强了Ara h 3与花生特异性Ig E和Ig G抗体的结合能力,这表明烘烤处理增强了Ara h 3的潜在致敏性。3烘烤花生Ara h 3致敏性增强的机理研究用Caco-2细胞单层模型和树突状细胞模型模拟了Ara h 3-Roasted对胃肠道免疫系统的影响。实验结果表明,Ara h 3-Roasted降低Caco-2细胞活力,抑制细胞增殖,促使ROS含量上升,氧化应激失衡激活NF-κB信号通路,导致促炎因子IL-6、IL-8和MCP-1含量上升;Ara h 3-Roasted降低Caco-2细胞单层跨膜电阻值,下调紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和JAM-1的基因表达,破坏Caco-2细胞上ZO-1的分布和Caco-2细胞单层屏障的完整性,最终导致Caco-2细胞单层对Ara h 3-Roasted蛋白转运增强,促进了胃肠道对Ara h 3-Roasted的吸收;Ara h 3-Roasted上调树突细胞清道夫受体成分LRP-1的基因表达,引起树突状细胞对Ara h 3-Roasted的摄取能力增强,上调Th2型炎症因子IL-10的基因表达,下调Th1型细胞因子IL-12的基因表达,进而引发更严重的Th2型过敏反应。