脑胶质瘤光学和磁共振双报告基因成像系统的构建

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目的:构建脑胶质瘤光学和磁共振成像双报告基因慢病毒系统,在体内外验证目的蛋白的表达,并进一步检测目的蛋白的成像功能。  方法:首先构建 FTH-EGFP-GV287慢病毒载体,进行慢病毒包装与生产,转染构建稳定表达铁蛋白重链、绿色荧光蛋白的细胞株F98-FTH-EGFP及仅表达绿色荧光蛋白的细胞株F98-EGFP,体内外验证FTH及其标记蛋白FLAG的表达,细胞及小动物水平验证光学成像的可行性,细胞及小动物水平验证铁蛋白储存铁的功能,验证MRI成像的可行性。  结果:将构建的光学和磁共振成像双报告基因慢病毒转染细胞后,通过免疫组化、WB、免疫荧光验证细胞成功的表达了EGFP与FTH。通过荧光显微镜与小动物光学成像仪,验证了体内外光学成像的可行性。但是在进行铁蛋白功能验证时,得到的是阴性结果,通过普鲁士蓝染色、原子吸收法均未检测到转染后细胞内铁的富集,体内外MRI上未检测到局部T2WI信号的下降。  讨论:虽然我们通过免疫荧光、免疫组化检测到了铁蛋白重链的过表达,但在铁蛋白储存铁功能验证时,我们得到的是阴性结果,通过阅读文献与相关阳性结果对比,考虑是由于在实验设计时,为了能够更好的、特异性更高的检测到过表达的铁蛋白,我们在铁蛋白重链的C端添加了一个3FLAG片段,这是由25个氨基酸所构成的标签蛋白,具有亲水性,影响了邻近的亚铁氧化酶的活性,使过表达的铁蛋白重链失去氧化亚铁离子的能力,不能储存铁离子。我们后续又构建了一个不带标签蛋白的过表达铁蛋白重链的质粒,用293T初步验证了实验组过表达的铁蛋白重链具有一定的储存铁的功能。
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