目的：探讨分离、体外培养、鉴定及体外标记兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法：选择健康幼龄新西兰大耳白兔,于双侧髂后上嵴及胫骨上端内侧部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培养法(直接贴壁法)分离培养MSCs,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律。对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞术对CD34、CD44、CD45、CD105四种MSCs表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyuridine, BrdU)体外标记兔MSCs,检测不同标记时间和标记浓度的标记阳性率。结果：全骨髓培养法培养的原代MSCs接种4天后可以被观察到,形态均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7-8天MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第4-8天为高速生长期,MSCs在第3-5代生长最为旺盛。经流式细胞术鉴定,CD34 (-)、CD45 (-)、CD44 (+)、CD105(+),证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU体外标记兔MSCs的阳性率达到85-90%,40μmol/L、标记72h为最佳标记浓度和标记时间。结论：应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞且操作简便,效率高,经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。应用BrdU体外标记兔MSCs是安全可靠的。目的：建立兔烟雾吸入性损伤模型。方法：采用自制烟雾吸入性损伤致伤仪致伤。以干燥的松木屑及煤油为发烟材料,在密闭环境使兔自行吸入烟雾10min,间隔2min再次致伤10min。伤后观察兔临床表现、各时点血气及伤后24h肺组织切片观察。结果：(1)伤后兔呼吸频率明显加快,呼吸困难明显,肺部可及干啰音,24h后呼吸症状改善。(2)血气示PaO2由伤前90.20±18.44mmHg分别降至伤后10min 63.48±12.90mmHg、伤后2h 56.96±10.23mmHg及伤后4h 65.76±12.55mmHg,与伤前比较差异有显著性(P<0.05)。至伤后24h基本恢复正常；PaCO2由伤前32.10±5.48mmHg分别升至伤后10min 41.72±6.33mmHg、伤后2h 43.12±5.42mmHg及伤后4h 39.11±6.91mmHg与伤前比较差异有显著性(P<0.05)。至伤后24h基本恢复正常。(3)组织病理学观察：大体观见伤肺苍白,包膜紧张,大片出血灶；光镜下见血管内充血、肺泡水肿和出血、间质水肿及炎性细胞浸润等肺损伤改变。结论：本文推荐的兔烟雾吸入性损伤模型是一种简便、实用、稳定、经济、重复性好的烟雾吸入性损伤模型,适于烟雾吸入性损伤的研究。目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)移植对烟雾吸入性损伤兔炎症反应的影响,评价MSCs移植的治疗效果,初步揭示MSCs移植对烟雾吸入性损伤影响的可能机制。方法：64健康新西兰大耳白兔随机数字表法分为2组：烟雾吸入性损伤组(S组)和MSCs治疗组(M组),每组各32只动物。另取8只动物做正常对照组测基础值。正常对照组不致伤,仅经耳缘静脉注入10ml PBS液；S组致伤后立即经耳缘静脉注入10ml PBS液；M组致伤后立即经耳缘静脉注入内含1×107个第三代兔MSCs的PBS液10ml。S组和M组伤后分为2h、4h、6h、24h观察,每个时间点8只动物,主要观察指标和方法：①采用ELISA法检测正常对照值、S组和M组伤后2h、4h、6h外周血以及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)含量并作比较。②采用RT-PCR法检测S组和M组伤后2h、4h、6h肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA的表达并作比较。③检测正常对照组、S组和M组伤后6h和24h肺水质量分数并作比较。④大体和光镜下分别观察正常对照组、S组和M组伤后2h、4h、6h、24h肺组织和支气管组织的变化。结果：(1)促炎因子：实验开始后2h、4h、6h,M组外周血和肺组织中主要促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α含量与相应S组对应时间点值相比均显著降低(P<0.05)。S组外周血和肺组织中主要促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α含量与相应组内正常对照值相比均显著升高(P<0.05)。M组外周血和肺组织中IL-1β含量与组内正常对照值相比无显著差异(P>0.05),M组外周血和肺组织中TNF-α含量与组内正常对照值相比显著升高(P<0.05),与组内正常对照值相比,肺组织中IL-6含量显著升高(P<0.05)而外周血IL-6含量无显著差异(P>0.05)。(2)抗炎因子：实验开始后2h、4h、6h,M组外周血主要抗炎因子IL-10含量与相应S组对应时间点值相比均显著升高(P<0.05),M组和S组2h、4h、6h含量较各自正常对照值均显著升高(P<0.05)；M组肺组织中IL-10含量与相应S组对应时间点值相比,4h和6h显著升高(P<0.05)而2h升高不显著(P>0.05)。组内比较,S组2h、4h、6h IL-10含量较正常对照值差异不显著(P>0.05),M组4h和6h显著升高(P<0.05)而2h升高不显著(P>0.05)。(3)VEGF水平：S组和M组外周血与肺组织中VEGF水平伤后2h、4h、6h迅速升高,与正常对照值比较均显著升高(P<0.05)。M组外周血伤后各时间点VEGF水平与S组对应时间点相比,VEGF值却显著下降(P<0.05)；而M组肺组织伤后各时间点VEGF水平与S组对应时间点相比VEGF值却显著升高(P<0.05)。(4)主要炎症因子的mRNA表达：TNF-α,IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量在M组4h和6h显著低于S组相应时间点TNF-α,IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量(P<0.05),仅M组2h IL-6 mRNA相对表达量与相应时间点比较无显著差异(P>0.05)；M组各时间点IL-10 mRNA相对表达量均显著高于S组相应时间点IL-10 mRNA相对表达量(P<0.05)。(5)处置后6h和24h,M组实验结束后肺水质量分数较S组均显著降低(P<0.05)。S组和M组6h和24h与正常对照值比较均显著升高(P<0.05)。(6)病理学观察：大体观察：从色泽、包膜紧张度、光滑度、充血状况、出血坏死灶大小、分泌物等指标综合观察,M组各时间点较S组改善明显,正常对照组和U组未见异常。组织病理学观察：从上皮脱落、充血、出血、渗出、肺泡隔情况、肺水肿、肺不张、肺气肿、炎症细胞浸润、成纤维细胞增生等指标综合观察,M组各时间点支气管和肺组织较S组改善明显,正常对照组结构正常。结论：MSCs静脉移植至烟雾吸入性损伤兔体内,能显著降低其全身和局部主要促炎因子水平,升高其全身和局部抗炎因子水平,减少其血管外肺水,改善肺和气管组织损伤程度,对烟雾吸入性损伤具有抗炎保护作用。抗炎-免疫调节作用是MSCs移植对烟雾吸入性损伤治疗作用的另一主要机制。目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)移植对烟雾吸入性损伤兔组织修复的影响。方法：32健康新西兰大耳白兔随机数字表法分为4组：正常对照组(C组)、正常对照+MSCs治疗组(U组)、烟雾吸入性损伤组(S组)和MSCs治疗组(M组),每组8只实验动物。C组不致伤,仅经耳缘静脉注入10ml PBS液；U组也不致伤,仅经耳缘静脉注入内含1×107个BrdU标记的第三代兔MSCs的PBS液10ml；S组致伤后立即经耳缘静脉注入10ml PBS液；M组致伤后立即经耳缘静脉注入内含1×107个BrdU标记的第三代兔MSCs的PBS液10ml。4组分为7d和28d两个时间点观察,每个观察点4只动物,主要观察指标和方法：①大体和光镜下分别观察4组伤后7d和28d肺组织和支气管组织的变化。②采用免疫组化技术观察4组处置后7dMSCs体内“归巢”情况；采用免疫组化双染色技术观察4组处置后28dMSCs体内分化情况。结果：①大体观察：从色泽、包膜紧张度、光滑度、充血状况、出血坏死灶大小、分泌物等指标综合观察,M组7d和28d较S组改善明显,C组和U组未见异常。组织病理学观察：从上皮脱落、充血、出血、渗出、肺泡隔情况、肺水肿、肺不张、肺气肿、炎症细胞浸润、成纤维细胞增生等指标综合观察,M组7d和28d支气管和肺组织较S组改善明显,C组和U组结构正常。②免疫组织化学染色显示M组BrdU标记的MSCs伤后7天能在支气管组织和肺组织中大量“归巢”,而C组、S组及U组未见或者极少见“归巢”。③免疫组化双染色显示M组可见水通道蛋白-5(AQP-5)和BrdU双染阳性细胞,说明MSCs在肺内能分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞；可见碱性磷酸酶(AKP)和BrdU双染阳性细胞,说明MSCs在肺内能分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞；可见CD34和BrdU双染阳性细胞,说明MSCs在肺内能分化为肺血管内皮细胞。C组、U组、S组均未见上述双染色阳性细胞。结论：经静脉移植至烟雾吸入性损伤兔体内的MSCs均能“归巢”至损伤和炎症反应明显的肺组织和支气管组织区域并分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞以及肺血管内皮细胞,减轻肺组织损伤,可能参与并加快了烟雾吸入性损伤的组织修复过程。