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目的:杂色曲霉素(Sterigmatocystin,ST)是由杂色曲霉、构巢曲霉等真菌所产生的一种具有致癌性的真菌毒素。ST广泛存在于自然界中,是动物和人类食物中常见的污染物之一,在我国胃癌高发区慢性胃病患者胃液内的检出率及粮食中的污染率均很高。国内外研究表明,ST可引起小鼠肺腺癌和腺胃黏膜上皮异型增生,可诱导人胃上皮细胞出现非程序性DNA合成,在人消化道肿瘤组织中可检出ST-DNA加合物,引起基因突变,从而诱发细胞癌变。肿瘤是以细胞生长失控为主要特征的,细胞在增殖、分化和凋亡方面的异常都可能导致肿瘤的发生和发展。目前认为细胞周期紊乱是肿瘤重要的发生机制。本实验室前期研究发现ST可诱导并促进小鼠大脑细胞、肾脏细胞和肝脏细胞的凋亡,并抑制肝细胞的增殖;诱导体外培养人外周血淋巴细胞发生凋亡;诱导体外培养人胚胃黏膜细胞出现细胞增殖活性增高。近期研究发现,ST处理24h,可影响胃黏膜上皮细胞(GES-1)细胞增殖和细胞周期分布,诱导GES-1细胞周期发生G2期阻滞。但ST诱导细胞发生G2期阻滞的机制目前尚不清楚。G2/M期是细胞周期调控点之一,是细胞增殖的重要阶段。真核细胞中,G2-M进程由细胞周期蛋白B(CyclinB)-Cdc2复合物调控。Cyclin B1/Cdc2是由Cdc25C激活从而促进细胞从G2期进入M期,Cdc25C的活性是细胞周期进入M期的关键之一。因此,在前期研究的基础之上,本实验研究了ST对体外培养胃黏膜上皮细胞的CyclinB1、Cdc2、Cdc25C表达的影响,以期探讨G2期阻滞的相关分子的变化在ST诱导胃黏膜上皮细胞G2期阻滞中的意义。方法:1细胞培养与处理GES-1细胞培养于含10%胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基中,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长。选择对数生长期的细胞(传代后24h)随机分为空白对照组、溶剂对照组、实验组。实验组给予DMSO溶解、生理盐水稀释的ST,使其终浓度分别为100、500、1000、2000μg/L,对照组给予等体积生理盐水,溶剂对照组给予等体积DMSO溶液,继续培养24h收集细胞进行相关指标检测。2蛋白免疫印迹(Western Blotting)提取细胞总蛋白,用蛋白免疫印迹方法,检测ST处理后人胃黏膜上皮细胞GES-1中CyclinB1、Cdc2/磷酸化型Cdc2和Cdc25C/磷酸化型Cdc25C的表达情况。3细胞总RNA的提取、鉴定及定量采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。1%琼脂糖电泳鉴定其完整性。紫外分光光度计进行定量。4 RT-PCR检测mRNA的表达检测不同处理组对人胃黏膜上皮细胞GES-1中Cyclin B1,Cdc2和Cdc25C mRNA表达的影响。采用凝胶分析软件(BIO-LD)对凝胶进行定量,各组以目的基因与内参照基因GAPDH量的比值表示目的基因相对表达量。5统计采用SPSS13.0软件进行相关分析与单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA),数据用x±s表示。结果:1 ST对体外培养GES-1细胞细胞周期相关蛋白表达的影响1.1蛋白免疫印迹检测CyclinB1蛋白的表达CyclinB1蛋白分子量为48KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,GES-1细胞空白对照组、溶剂对照组、ST处理组均在48KD位置出现了阳性荧光条带。以β-acti(n42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,结果表明, ST处理可以使GES-1细胞CyclinB1蛋白的表达增高(P<0.05)。1.2蛋白免疫印迹检测Cdc2的去磷酸化水平Cdc2的蛋白分子量为34KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,GES-1细胞空白对照组、溶剂对照组、ST处理组均在34KD位置出现了阳性荧光条带。以β-acti(n42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,结果表明,与对照及溶剂对照组相比,ST处理组GES-1细胞Cdc2的去磷酸化水平明显降低(P<0.05)。1.3蛋白免疫印迹检测Cdc2的磷酸化水平磷酸化型Cdc2的蛋白分子量为34KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,GES-1细胞空白对照组、溶剂对照组、ST处理组均在34KD位置出现了阳性荧光条带。以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,结果表明,与对照及溶剂对照组相比,ST处理组GES-1细胞Cdc2的磷酸化水平显著增高(P<0.05)。1.4蛋白免疫印迹检测Cdc25C的表达Cdc25C的蛋白分子量为60KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,GES-1细胞空白对照组、溶剂对照组、ST处理组均在60KD位置出现了阳性荧光条带。以β-acti(n42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,结果表明,与对照及溶剂对照组相比,ST处理可以使GES-1细胞Cdc25C表达降低(P<0.05)。1.5蛋白免疫印迹检测Cdc25C的磷酸化水平磷酸化型Cdc25C的蛋白分子量为60KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,GES-1细胞空白对照组、溶剂对照组、ST处理组均在60KD位置出现了阳性荧光条带。以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,结果表明,与对照及溶剂对照组相比,ST处理组GES-1细胞Cdc25C的磷酸化水平明显增高(P<0.05)。2 ST对体外培养GES-1细胞CyclinB1、Cdc2和Cdc25C mRNA表达的影响2.1 RT-PCR检测CyclinB1 mRNA的表达RT-PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳及半定量分析表明,溶剂对照组和对照组细胞内Cyclin B1 mRNA的表达没有明显差别。给予ST作用24h后,在0～2000μg/L ST浓度范围内,与溶剂对照组相比,GES-1细胞CyclinB1 mRNA的表达量逐渐升高,与ST浓度呈显著正相关关系(r=0.818,n=3,P<0.01)。2.2 RT-PCR检测Cdc2 mRNA的表达RT-PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳及半定量分析表明,溶剂对照组和对照组细胞内Cdc2 mRNA的表达没有明显差别。给予ST作用24h后,在0～2000μg/L ST浓度范围内,与溶剂对照组相比,GES-1细胞Cdc2 mRNA的表达量逐渐升高,剂量依赖关系显著(r=0.962,n=3,P<0.01)。2.3 RT-PCR检测Cdc25C mRNA的表达RT-PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳及半定量分析表明,溶剂对照组和对照组细胞内Cdc25C mRNA的表达没有明显差别。给予ST作用24h后,在0～2000μg/L ST浓度范围内,与溶剂对照组相比,GES-1细胞Cdc25C mRNA的表达量逐渐降低,与ST浓度呈明显负相关关系(r=-0.881,n=3,P<0.01)。结论:1 ST可剂量依赖性的上调GES-1细胞CyclinB1在蛋白质水平上的表达,同时使Cdc2和Cdc25C的磷酸化水平上升,而降低Cdc2的去磷酸化水平和Cdc25C的表达。2 ST可以上调GES-1细胞CyclinB1和Cdc2在mRNA水平上的表达,下调Cdc25C在该水平上的表达。3研究结果提示,ST处理24h,可能通过影响GES-1细胞中CyclinB1、Cdc2和Cdc25C在转录和翻译水平上的表达,进而诱导GES-1细胞发生G2期阻滞有关。