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泛素在真核生物体内广泛存在,且功能重要。泛素可修饰蛋白质底物,并参与基因转录调控、蛋白质结构、定位甚至蛋白质命运。泛素化修饰系统由四个主要成分组成,即泛素激活酶E1,泛素结合酶E2,泛素连接酶E3以及去泛素化酶DUB。这些成员相互协调组成复杂精细的调控网络,维持细胞内环境的稳定。其中E3种类繁多,且与被修饰底物的特异性紧密相关而广受关注,但由于其底物鉴定的技术困难,亟待开展深入研究。蛋白质组学是系统鉴定和定量样品中所有的蛋白质,并进行功能研究的新兴学科,其大规模鉴定和精准定量的优势为泛素连接酶底物的筛选提供了便利。目前常用的泛素连接酶底物筛选策略包括目的基因的敲除或过表达两种。然而,究竟哪一种更适用于泛素连接酶底物的筛选仍未有定论。本课题以酿酒酵母为研究对象,旨在系统比较泛素连接酶底物筛选策略,建立高效、特异的筛选技术,为系列泛素连接酶底物的大规模筛选奠定技术基础。我们利用酵母表达载体pUC57,以JMP024菌株（Xu Lab）[1]为宿主,成功构建了40种酵母泛素连接酶E3的过表达菌株,并对其生长状况进行了检测。结果显示除少数泛素连接酶过表达菌株表现出轻微生长阻滞状况外,其余菌株均能正常生长。为研究氧相关泛素连接酶底物,我们以对氧化刺激敏感的HRT3为对象,对底物鉴定技术进行了深入比较。研究表明,携带HRT3高表达调控盒的pUC57质粒可能影响了JMP024菌株中携带His-Ub的pUB221质粒复制,从而影响底物筛选效果。为此我们进一步构建了基因组整合型过表达HRT3菌株。利用SILAC技术,我们对质粒过表达HRT3菌株（正常和蛋白酶体抑制剂MG132处理后）、基因组整合型HRT3过表达菌株及HRT3敲除菌株的泛素化蛋白质组进行了分析,结果发现,同对照菌JMP024相比,HRT3敲除菌株的泛素化蛋白质组变化不明显,而基因组整合过表达菌株的泛素化蛋白质组则表现出明显上调分布。数据分析结果证明过表达HRT3菌株对潜在底物泛素化水平变化的贡献是敲除HRT3菌株的2.7倍（0.8:0.3）,变化差异是敲除菌株的2倍（SD:0.16:0.08）。并且基因组整合过表达菌株比敲除菌株共鉴定泛素化蛋白的序列覆盖度提高了98%,为深入比较潜在底物变化趋势提供了基础。此外,在对HRT3已报道底物（DLD3,GRS1）的鉴定情况进行比较时,过表达策略对其变化幅度的贡献也明显优于敲除菌株。表明过表达策略能够实现底物泛素化水平更明显的变化,从而更适用于E3底物的筛选。定量蛋白质组学的数据分析得到54个潜在的HRT3修饰底物及10个潜在的修饰位点,包括一个可能与HRT3氧化刺激表型相关的底物——NCE103。该研究为泛素连接酶底物的筛选提供了有效的技术支撑。