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【目的】鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是东南亚和我国南方地区高发的癌症之一,放疗为其治疗首选。目前,早期NPC 5年生存率可达95%以上,由于NPC早期症状隐匿,75%以上的初诊患者被确诊为晚期,而局部晚期NPC 5年总生存率只有78.4~80%,且有20~30%患者发生局部治疗失败或远处转移。因此,研究NPC的发病机制,探索理想的肿瘤标志物用以早期诊断NPC具有重要意义。miRNAs在癌症中的表达失调,已逐渐成为癌症诊断的重要标志。NPC和EBV感染联系紧密,EBV在NPC细胞中仅表达少数病毒蛋白,但大量表达BARTs miRNA。本课题组前期研究发现miR-BART13在C666-1细胞中高表达,并可分泌到细胞外;miR-BART13在NPC患者的血浆中特异高表达,其表达水平与其N分期、临床分期显著正相关,且在放疗完成时降至接近0。因此,血浆miR-BART13有可能作为NPC的早期诊断、疗效评估及预后判断指标,进一步研究miR-BART13在NPC发生发展中的分子机制,可为NPC肿瘤标志物和治疗新靶点的应用研究提供理论依据。基于此,本研究主要从细胞水平初步探讨miR-BART13对NPC细胞的免疫逃逸及侵袭转移的影响及其可能的作用机制。【材料和方法】1.将LV-miR-BART13慢病毒感染不含EBV的NPC细胞株CNE-1或将LV-miR-BART13 sponge慢病毒感染含有EBV的NPC细胞株C666-1后,使CNE-1稳定过表达miR-BART13或C666-1细胞稳定下调miR-BART13,分别与NK细胞共培养4h,通过流式细胞术和LDH检测NK细胞对各靶细胞的杀伤活性,用ELISA法和流式细胞术分别检测各靶细胞诱导NK细胞分泌IFN-γ和表达CD107a的能力。2.利用双荧光素酶基因报告系统、RT-qPCR、Western Blot及流式细胞术检测miR-BART13对ULBP4的调控作用。利用RT-qPCR和免疫组化检测ULBP4在NPC和正常鼻咽黏膜组织的mRNA和蛋白表达,分析111例NPC患者的ULBP4蛋白表达高低与患者临床特点及预后的相关性;利用LV-ULBP4慢病毒分别感染5-8F、C666-1细胞后,LDH检测NPC细胞过表达ULBP4对NK细胞杀伤功能的影响。将LV-ULBP4慢病毒感染CNE-1-BART13细胞或将LV-si-ULBP4慢病毒感染C666-1-BART13 sponge细胞,分别回复ULBP4表达,与NK细胞共培养4h,通过流式细胞术检测NK细胞对各靶细胞的杀伤活性,用ELISA和流式细胞术分别检测各靶细胞诱导NK细胞分泌IFN-γ和表达CD107a的能力。3.利用细胞划痕、Transwell迁移及Transwell侵袭实验检测CNE-1稳定过表达miR-BART13或C666-1稳定下调miR-BART13后对NPC细胞迁移和侵袭能力的影响;通过细胞形态学变化观察miR-BART13表达对NPC细胞EMT的影响;通过Western Blot检测miR-BART13表达对NPC细胞侵袭转移和EMT相关分子蛋白的影响。4.利用生物信息学软件预测结合细胞蛋白质谱检测行交叉分析,探讨miR-BART13可能直接调控的且与转移密切相关的靶基因,并对可能靶基因进行细胞水平上的RT-qPCR和Western Blot检测。Western Blot检测miR-BART13过表达或下调对可能靶基因相关的NPC转移通路蛋白的影响。【结果】1.CNE-1细胞稳定过表达miR-BART13后和NK细胞共培养4h后,与对照组比较,效靶比10:1时流式检测示NK细胞对其杀伤率降低,ELISA法和流式检测示其诱导NK细胞分泌IFN-γ和表达CD107a能力下降,不同效靶比(10:1,20:1,40:1)时LDH检测示其对NK细胞杀伤的敏感性均降低。C666-1细胞稳定下调miR-BART13后和NK细胞共培养4h后,与对照组比较,其结果与上述相反。2.通过双荧光素酶基因报告系统、RT-qPCR、Western Blot及流式检测表明ULBP4为miR-BART13直接下调的靶点。RT-qPCR和免疫组化分析ULBP4 mRNA和蛋白水平在鼻咽癌组织中较低表达,患者ULBP4蛋白表达水平与临床特点无明显相关性,但ULBP4低表达是潜在影响患者总生存(OS)、无瘤生存(DFS)及无远处转移生存(DMFS)的独立预后因素;采用3种效靶比(10:1,20:1,40:1)时,LDH检测示5-8F和C666-1细胞过表达ULBP4后,均可增强NK细胞的杀伤活性。进一步行“Rescue”实验,即CNE-1-BART13细胞过表达ULBP4后与NK细胞共培养4h后,与对照组比,效靶比10:1时流式检测示NK细胞对其杀伤率增强,其诱导NK细胞分泌IFN-γ和表达CD107a的能力增强;C666-1-BART13sponge细胞上敲降ULBP4后与NK细胞共培养4h后,与对照组比,其结果与上述相反。3.CNE-1细胞过表达miR-BART13后,表现为迁移和侵袭能力增强,MMP9蛋白表达上调,TIMP2蛋白表达下调;形态纤长,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Vimentin、β-catenin、ZEB1蛋白表达上升。然而,C666-1下调miR-BART13后,表现为与上述相反的变化,形态类椭圆。4.通过交叉分析,结果显示NKIRAS2可能为miR-BART13直接调控的转移靶点。C666-1细胞下调miR-BART13后,NKIRAS2的mRNA和蛋白水平表达上调。进一步分析miR-BART13对NF-κB信号通路的影响,C666-1细胞下调miR-BART13后,表现为IκBα、IκBβ蛋白表达上调,磷酸化NF-κB(p65)及细胞核NF-κB(p65)蛋白表达降低。然而,CNE-1细胞过表达miR-BART13后,表现为与上述相反的变化。【结论】1、miR-BART13通过下调ULBP4的表达促使NPC细胞逃避NK细胞的杀伤。2、NPC组织中的ULBP4 mRNA和蛋白水平为较低表达,ULBP4低表达是潜在影响NPC患者OS、DFS及DMFS的独立预后因素。3、miR-BART13通过活化NF-κB信号通路促进NPC细胞的迁移、侵袭和EMT进展。