乳腺癌严重威胁着妇女健康,是许多妇女死亡的主要原因。乳腺癌患者的远期生存率仍不容乐观,40%左右的病人因乳腺癌的复发而死亡。尽管手术、传统化疗,尤其近年兴起的血管生成抑制疗法对提高乳腺癌患者的临床治疗效果发挥了重要作用,但是血管生成抑制之后导致无氧代谢增加,进而增加了肿瘤的恶性程度和转移,严重限制了血管生成抑制剂在临床的应用和病人预后的改善,已成为肿瘤治疗的一大难题。因此,进一步研究乳腺癌血管形成及糖酵解促进乳腺癌增殖转移的分子机制,寻找新的作用靶点,有望进一步改善乳腺癌患者的防治水平,具有十分重要的意义。血管生成是在组织低氧和酸性环境下引起的,通过激活和启动血管生成,可以为肿瘤细胞提供适当的氧气供应和去除有毒的代谢物。血管生成过程相对复杂,并受多种促血管生成因子的调控。而肿瘤细胞产生的缺氧诱导因子1A(Hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF1A)和糖酵解过程中产生的乳酸可以通过调控血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表达来促进血管形成,进而维持自身氧气和营养供应。自噬对于维持细胞稳态和适应各种形式的压力至关重要,主要分为大自噬、小自噬和分子伴侣自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。在三种不同类型的自噬途径中,CMA是通过热休克蛋白70(heat shock cognate protein of 70 k Da,HSC70)识别五个短肽序列(KFERQ),然后靶向牵引底物与溶酶体相关膜蛋白2A(lysosome associated membrance protein 2A,LAMP2A)结合进入溶酶体进而选择性降解受损的可溶性细胞蛋白。最近,对CMA如何影响癌细胞发病和进展的兴趣日益增加。研究发现CMA可以通过选择性降解底物蛋白来分别促进肺癌细胞和胃癌细胞的增殖。然而,CMA在乳腺癌血管形成中的作用及其分子机制目前国内外尚未见报道。为此,本研究采用慢病毒介导的shRNA和过表达技术、组织芯片、免疫荧光、荧光定量PCR、蛋白原核表达与纯化、溶酶体提取、溶酶体体外吞噬、Western Blot和siRNA转染、免疫组化、血管形成、克隆形成、MTT、划痕试验、Transwell迁移、裸鼠皮下成瘤、ELISA检测、细胞外酸化率(ECAR)、耐药等多种体内外模型,观察CMA在乳腺癌血管形成中的作用,并初步阐明其分子机制。主要结果:一、CMA促进乳腺癌细胞增殖、转移与耐药(1)通过免疫组化在21例癌旁正常组织和166例乳腺癌组织芯片中分析CMA与乳腺癌的恶性程度、转移、预后的关系,结果发现,CMA途径中的关键限速蛋白LAMP2A的表达情况与乳腺癌的恶性程度和转移的淋巴结组织具有显著差异,并且随着病理组织分级越高,LAMP2A表达越高,且增加的LAMP2A表达与患者的总体生存率相关,LAMP2A表达低的患者的总生存率远远高于LAMP2A表达较高的患者。(2)通过LAMP2A shRNA慢病毒表达载体感染技术,成功构建了另一段shRNA感染的LAMP2A低表达MDA-MB-231细胞,分别采用7天MTT增殖曲线和Transwell小室迁移实验观察分子伴侣自噬对MDA-MB-231增殖和迁移的作用,发现LAMP2A高表达后能够增强乳腺癌细胞增殖与转移。(3)使用LAMP2A shRNA敲低技术,成功构建了不同LAMP2A表达的MCF10A乳腺上皮细胞株,采用Western Blot技术进行验证。分别采用7天MTT增殖曲线和Transwell小室迁移实验观察CMA对乳腺细胞增殖和迁移的作用,结果发现CMA不能促进乳腺细胞MCF10A的增殖与转移。并且,荧光定量PCR结果发现CMA不能对ATG5的m RNA水平产生影响。(4)采用MTT增殖实验检测CMA对乳腺癌细胞化疗药物耐药的影响,结果发现降低LAMP2A分子表达能增强多柔比星和紫杉醇对乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF7的杀伤作用,而LAMP2A过表达能增强乳腺癌细胞株对紫杉醇和多柔比星的耐药性。此外,在低、中、高浓度的多柔比星和紫杉醇对MDA-MB-231和MCF7细胞株的杀伤实验发现,药物作用呈显著的剂量依赖性。二、CMA在乳腺癌血管形成中的作用1.不同LAMP2A表达水平的乳腺癌细胞株构建及其CMA活性检测(1)通过LAMP2A shRNA和过表达慢病毒表达载体感染技术,成功构建了不同LAMP2A表达的乳腺癌细胞株MCF-7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-436,并且使用Western Blot方法和荧光定量PCR技术验证了LAMP2A表达及所选的LAMP2A shRNA的特异性。(2)采用免疫荧光法间接观察LAMP2A高低表达不同乳腺癌细胞株的CMA活性结果发现应用慢病毒感染技术下调MDA-MB-231、MDA-MB-436、T47D和MCF7乳腺癌细胞中LAMP2A表达后,其LAMP2A阳性标记的溶酶体与核周间距显著增加,说明分子伴侣自噬活性明显降低,而LAMP2A过表达后,LAMP2A标记阳性的溶酶体向核周聚集明显增加。(3)首先通过超声破碎及超高速离心后获得溶酶体,并采用β氨基己糖苷酶释放实验检测溶酶体膜完整性,结果发现提取的溶酶体膜完整性达到95%以上,采用Western Blot验证溶酶体中HSP60、β-Actin和LAMP2A表达情况,结果发现提取的溶酶体组分非常专一。通过人GAPDH和HSC70 c DNA的原核诱导表达并纯化获得了GAPDH和HSC70高纯度的蛋白。采用溶酶体体外GAPDH吞噬实验观察LAMP2A高低表达不同乳腺癌细胞株的CMA活性,结果发现,LAMP2A敲低的MDA-MB-231细胞,体外吞噬GAPDH能力明显减弱,而LAMP2A高表达的MDA-MB-231细胞,体外吞噬GAPDH能力明显增强。2.体外细胞实验检测CMA对乳腺癌血管形成影响(1)通过血管内皮细胞管腔形成实验观察不同CMA活性的乳腺癌细胞上清对乳腺癌血管形成影响,结果发现在MDA-MB-231、T47D、MCF7和MDA-MB-436乳腺癌细胞中高表达LAMP2A后,血管内皮细胞管腔形成明显增加,而在MDA-MB-231、T47D、MCF7和MDA-MB-436乳腺癌细胞中敲低LAMP2A后,管腔形成明显减少。(2)采用colony formation实验检测不同LAMP2A表达的乳腺癌细胞上清对人脐静脉内皮细胞增殖的作用,结果发现,在MDA-MB-231、T47D、MCF7和MDA-MB-436乳腺癌细胞中LAMP2A高表达后能明显增强血管内皮细胞克隆形成,而在MDA-MB-231、T47D、MCF7和MDA-MB-436乳腺癌细胞中LAMP2A敲低后能明显抑制人脐静脉血管内皮细胞克隆形成。(3)采用7天MTT生长曲线实验观察不同CMA活性的乳腺癌上清对人脐静脉内皮细胞增殖的影响,实验证实在T47D和MDA-MB-231乳腺癌细胞中降低LAMP2A表达后能抑制人脐静脉内皮细胞增殖,而在MDA-MB-231、和T47D乳腺癌细胞中LAMP2A高表达后能够显著增强血管内皮细胞增殖。(4)采用Transwell小室迁移实验检测不同CMA活性的乳腺癌上清对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响,实验证实,在MCF7和MDA-MB-231细胞中,沉默LAMP2A后能显著抑制血管内皮细胞迁移,而在MDA-MB-231和MCF7细胞中过表达LAMP2A后则能促进血管内皮细胞迁移。(5)采用划痕实验观察不同CMA活性的乳腺癌上清对血管内皮细胞迁移能力的影响,结果发现,在MDA-MB-436和T47D细胞中敲低LAMP2A后,人脐静脉内皮细胞伤痕愈合速度显著降低,而在T47D和MDA-MB-436细胞LAMP2A高表达后,内皮细胞伤痕愈合率明显加快。3.体内动物实验检测CMA对乳腺癌血管形成影响采用Western Blot验证LAMP2A不同表达的乳腺癌细胞小鼠皮下成瘤模型中LAMP2A表达情况,结果发现敲低LAMP2A后,小鼠皮下瘤组织内LAMP2A仍然低表达,说明模型构建成功。采用免疫组化检测MDA-MB-231细胞皮下肿瘤动物模型中CD31和CD34的表达水平,结果发现,敲低LAMP2A后,血管内皮标志物CD31和CD34表达明显减低,并且肿瘤细胞生长减慢,转移减少。上述结果表明CMA可以促进血管形成,并与其促进乳腺癌增殖转移密切相关。三、CMA对促血管形成因子的影响1.采用荧光定量PCR检测分子伴侣自噬对乳腺癌细胞不同促血管生成因子表达的情况,结果发现敲低LAMPA后,在MCF7和MDA-MB-231细胞上血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)表达明显降低,而过表达LAMP2A后,在MCF7和MDA-MB-231细胞上VEGFA明显增加。2.采用Western Blot检测分子伴侣自噬对乳腺癌细胞VEGFA表达的情况,结果发现LAMP2A升高后,MDA-MB-436和MCF7细胞中VEGFA表达水平明显升高,而LAMP2A敲低后,MDA-MB-436和MCF7细胞中VEGFA表达水平明显下降。3.采用ELISA检测分子伴侣自噬对乳腺癌细胞VEGFA表达的情况,结果发现LAMP2A敲低后,MDA-MB-231细胞上清中VEGFA表达水平明显下降,而LAMP2A升高后,MDA-MB-231细胞上清中VEGFA表达水平明显升高。4.将LAMP2A高低表达不同的乳腺癌细胞株MDA-MB-436进行裸鼠皮下成瘤实验后,采用Western Blot检测分子伴侣自噬对乳腺癌皮下成瘤组织内VEGFA表达的情况,结果发现LAMP2A敲低后,MDA-MB-436瘤组织内VEGFA表达水平明显下降,而LAMP2A升高后,MDA-MB-436瘤组织内VEGFA表达水平明显升高。四、CMA激活HK2、增强糖酵解1.CMA对糖酵解及其关键酶的影响(1)采用乳酸试剂盒检测LAMP2A高低表达不同的乳腺癌细胞株MDA-MB-231上清中乳酸含量,结果发现LAMP2A敲低后,MDA-MB-231细胞上清中乳酸表达水平明显下降,而LAMP2A升高后,MDA-MB-231细胞上清中乳酸表达水平明显升高。(2)采用细胞外酸化率(ECAR)实验检测MDA-MB-231细胞内产酸量,结果发现敲低LAMP2A后,MDA-MB-231细胞糖酵解基线明显下降,而LAMP2A升高后,MDA-MB-231细胞糖酵解基线明显升高。(3)采用荧光定量PCR和Western Blot检测MDA-MB-231细胞内HK2的m RNA和蛋白水平的表达,结果发现LAMP2A敲低后,MDA-MB-231细胞内HK2表达水平明显下降,而LAMP2A升高后,MDA-MB-231细胞内HK2表达水平明显增加。2.敲低HK2能够减少血管形成(1)采用HK2siRNA转染后,荧光定量PCR验证HK2 siRNA敲低效果,结果发现HK2 siRNA能够成功敲低MDA-MB-231细胞中HK2的m RNA水平。(2)采用乳酸试剂盒检测HK2 siRNA敲低HK2后细胞外乳酸水平,结果发现敲低HK2后能够成功减低细胞外乳酸的表达水平。(3)采用管腔形成实验检测敲低HK2后对血管生成的影响,结果发现敲低HK2后能够显著减低CMA促血管形成的能力。(4)采用MTT增殖和Transwell迁移实验检测敲低HK2后对血管内皮细胞增殖和迁移的影响,结果发现敲低HK2后能够显著减低CMA促血管内皮细胞增殖和迁移的能力。3.糖酵解降低后对不同LAMP2A表达水平的乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响(1)采用HK2 siRNA转染、2-DG和无糖刺激MDA-MB-231细胞,采用MTT增殖实验检测降低糖酵解后对乳腺癌细胞增殖的影响,结果发现降低糖酵解后,能够明显减低CMA促乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖能力。(2)采用Transwell migration实验检测降低糖酵解后对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响,结果发现降低糖酵解后,乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移明显减低。结论:1.CMA促进乳腺癌血管形成,且与其促进乳腺癌增殖转移有关。2.CMA促进乳腺癌血管形成的分子机制与其促进VEGFA表达及其激活HK2、增强糖酵解通路有关。本课题深化了CMA在乳腺癌血管形成机制中的认识,并有望为乳腺癌的有效治疗提供新的靶点和策略。