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转基因动物研究是目前生物科学的研究热点之一。家蚕是重要的经济昆虫，更是经典遗传学研究的模式生物之一。进行转基因蚕研究具有重要的理论意义和实用价值。它不仅为家蚕基因的结构、功能及表达调控的机制研究提供了帮助，也为家蚕的抗病育种研究及家蚕新品种的育成等提供了新途径，同时也为以家蚕为“生物反应器”的研究探索了新途径。 自1996年起，对转基因蚕研究中报告基因的选择、目的基因的利用、导入方法、整合与表达策略及其检测，以及在转基因蚕个体筛选和转基因蚕系统维持等方面进行了研究。本论文主要报告如下三个方面的结果，并在最后一章对转基因蚕技术进行了小结和讨论。 （1）新霉素抗性转基因蚕 以新霉素抗性基因（Neomycin resistance gene，NeoR）为选择标记，成功地筛选出阳性个体。首先构建了外源导入质粒pFN。其中含家蚕丝素重链基因片段，及蚕体内能高效启动的启动子IE和它驱动的抗新霉素基因。质粒经HindⅢ酶切线性化后，分别转染家蚕Bm-N细胞和导入家蚕早期受精卵中（产下后0～2小时）。在细胞水平，检测具有G418抗性的Bm-N细胞株基因组DNA显示：构建的线性外源质粒可插入细胞染色体，并能表达。在成体水平，经过把基因枪处理的蚕卵刚孵化的蚁蚕及以后各代，分别以含致死浓度新霉素的人工饲料饲育筛选48小时的方法，获得新霉素抗性转基因蚕。因通过这种饲育筛选方法，获得的个体数很可能就是转基因个体，所以减少了转基因后代的饲养规模和检测规模。 G2代和G4代转基因蚕基因组DNA的PCR扩增、Southern杂交检测结果表明：①NeoR基因已整合在家蚕染色体上；②获得了新霉素抗性转基因蚕；③新霉素抗性基因可作为转基因蚕研究中有效的选择标记。．︾．－︾ Q)抗NPV核酶转基因蚕 核酶（Ribozyme）是一种具有牛物催化活性的小 RNA分于，具有专一切害峋巴 mMA的特性。家蚕核多角体病毒（Bom… morl Nuclear Polyhedrosls％ms，BmNPV）病是生产实践中危害较为严晕的翻麻，本研究尝试将针对 N’I，V的核酶基因导入家蚕基因组，期望获得核酶转基因家蚕，利川其具有抑制病毒的复制、增殖的功能，减轻感染发病率，为养蚕牛)“卜控制核多角体病毒病的研究提供依据。 钉先，设计片。合成厂二联锤头状核酶p8 NRzNRz426，分别针对在家贞核多角体病稀复制中起霍要作川的匝 Jk山一mmediately early stage gene，IE)mNNA的二个4讣仆立／、＼；，X次，构建川厂家妖细胞水个和成体水个研究的联合，巨组质粒 pIE－Luc－Rz＊该)员粒禽家众核多AI体仙fly／ IE｝／j。力J’、荧光东酶（Luciferase）｝（＊＊人不旧卜N卜VI巳核酶从山pBN＊z＊b； 巾到顺＊pl巳卜nC－仇转染家证纠1胞株8＊－N ill，给该自1胞株接利。smNPV的纠人大川，瓜核灿V介家企细胞水个能介效抑制日inN＊V＊＊A V制；；进 小试将i亥联介质粒导入企人纣纠t：pIE－LllC－RZ f郴L4制例Z内L）］酶 At’ti线上t化)ti，)！U占卜枪法日入家灰＼’拟］受粘匀（G。），卜G；｛ 企的n龄第－大上h收邮分血淋巳进竹炎光素酶活性测走，筛选出阳性个体后，继续饲养：以后分别厂GZ、民、q、q代的二龄起蚕用N’I， V进行接种筛选，选出半致死浓度明显高厂对照区的蚕进行传代。其中民代获得一区对NP V抗性比对照组高约10倍的转基因蚕。对该区五龄蚕基因组DNA的 PCR检测和 Southern杂交显示，约有90％含有目的外源 DNA片段，核酶基因及荧光素酶 DNA均多拷贝地整合在家蚕染色体上。利用RT－PCR检测到蛹期核酶的表达，并巳表达产物具有体外切割活性。这也表明，荧光素酶基因是转基因蚕研究有效的报告基因之一。讨沦了核酶在家蚕抗病毒育种和转基因蚕方面的应用前景。 综合本章结果：核酶基因导入蚕体有效地抑制了 N’I，V DNA的复制、增殖；获得了一定程度上抗V的转基因蚕品种AF 2：也为利用核酶抑制病毒﹃！！．︾－病的“基因治疗”研究提供了参考。 （3）利用同源重组将 GFP导入家蚕、整合至nb－L链 鳞翅目昆虫及其细胞株，是利用杆状病毒表达系统表达同源重组蛋白的理想宿主之一。Yamao et al．门)年报告了利用杆状病毒 AcN’PV实现向家蚕染色体的基因（Gene Tarseting）打靶实验。我们在研究了转基因蚕的导入方法以及证实GFP可在家蚕系统表达之后，进一步尝试厂利用同源重组策略将GFP弓入家蚕染色体组。实验以蚕丝心蛋〔］轻链基区（ibroin light chain gene，Fib－L）外显子 2和 3为靶基冈，利用电穿孔方法导入外源基冈，同源氧gll GFP基因至FibL的内含f 2。营先采川 PCR的方法，扩“增出 F山－L的外拈 Je 2和外显－了3；；冉将它们同＊FP基因拼接在一起，构建成同源重组融合表达质粒pZGFP3。川电穿孔法将线性外源DNA 9入家蚕早期受精卵中。氏波长紫外灯照射后代茧，观察到有“亮（荧光）茧”出现；；纤P＊R检测q代转征冈蚕基