研究背景与目的神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)作为一种多发生在幼儿生长时期的非良性实性肿瘤,也是在儿童中最常见的颅脑外肿瘤,主要来自于机体的肾上腺髓质部分或者来自于椎体边上神经节内幼稚的胚胎细胞[1]。国内外研究结果显示:神经母细胞瘤好发年龄小于5岁,并且在发病率的统计上,是非中枢神经系统相关肿瘤和白血病外最高的,其总数占了所有15岁以下患儿的非良性肿瘤的8%～l0%[2,3]。神经母细胞瘤的原发部位最常见于肾上腺的髓质部分,之后是颈部、盆腔、纵膈及腹膜后等部位也常有发生。无症状性起病是神经母细胞瘤的特色,且症状没有明显的特异性,而在临床表现方面则和肿瘤发生的局部浸润、远处转移以及原发部位密切相关[4]。部分患儿由于肿瘤释放一些活性物质如血管活性肠肽等,可出现神经内分泌系统症状。也有患儿没有任何症状,仅通过影像学检查发现。神经母细胞瘤由于其在恶性程度的表现上相对较高,转移往往可能发生在早期,并且容易转移的位置主要包括骨髓、淋巴结、肾脏、皮肤及肝脏等组织[5]。目前神经母细胞瘤的主要治疗方式是采用相关多学科综合诊疗,但是现阶段治疗的方式在中低危组神经母细胞瘤患儿,其生存率明显提高,而在高危组患儿,其预后仍然不佳,在临床的治疗上困难重重[61。因此,探索关于神经母细胞瘤的细胞在发生和发展过程的新机制,并且寻找治愈神经母细胞瘤的新方法,从而增加患儿生存率以及降低死亡率,是极为重要的。mTOR(Mammalian target of rapamycin),其信号通路在生物学方面表现出多种功能,属于丝/苏氨酸蛋白激酶的一种[7]。目前已知mmTOR不单单能够在细胞转录及翻译的过程中产生生物学的功能,更是在各种肿瘤相关的细胞过程都接受mTOR的作用[8,9]迄今为止,多项相关的临床方面的证据和实验数据结果提示着异常激活的mTOR信号通路,其在神经母细胞瘤的发生发展中有着极其重要的影响。雷帕霉素(Rapamycin),是自在上世纪后期,科研工作者从分离的细菌中得到该种抗生素,其本质属于大环内酯类,属于mTOR特异性抑制剂的一种[10]。至今为止,该抗生素广泛应用于包括在肾移植以及各种药物相关洗脱支架等临床治疗,其已经拥有了权威的美国食品药品监督管理局(FDA)的准许。它的相关机能是能与他克莫司结合蛋白(FKBP)逐步影响而互相结合,并且通过抑制mTOR的生物学作用,从而致使S6K1以及eIF-4E在相关磷酸化活化进程受到阻断,同时也起到一定的扼制效果在蛋白的转录和翻译当中,以达到在抑制细菌、阻止肿瘤生长以及影响免疫抑制方面的结果[11]。因此,雷帕霉素及一些相关类似物,通过这种遏止mTOR的方式,从而达到拮抗肿瘤的目的,并且其作为一种新型疗法已经在多种非良性肿瘤治疗中起到较好的效果。多项实验研究都表明,雷帕霉素在对多种恶性肿瘤如胃肠道具有神经内分泌功能的肿瘤[12]、胃癌[13]、肺癌[14]及头颈部鳞癌[15]等具有一定的抑制作用。目前亦有研究表明雷帕霉素对神经母细胞瘤也具有一定的抑制作用[16]。然而现已知的雷帕霉素剂型相对单一,其只有简单的注射粉针剂,同时存在一些不可避免的缺点,包括靶向性相对较差、毒副作用相对较大、用药顺应性相对较差等,使其在临床治疗中不能充分利用[17]。关于合理地使用雷帕霉素治疗恶性肿瘤,并能同时较低其相关副作用,已成为人们未来研究的重中之重。水凝胶体系作为相对理想的载体,其吸收水分的性能十分良好,并在吸收水分的同时能维持原有的形状,相同地,其存在于人体组织时,大量水分被其吸收,不易使机体产生刺激或者造成相关免疫反应[18]。同时因为水凝胶存在许多良好的特性,比如水分子的渗透性、生物组织相容性,使其在多个生物及医药相关的领域具有良好的研究价值,常常被用来当各种蛋白质和其他有生物活性的相关材料的释放类型载体[19,20]。而可注射性水凝胶体系是其中较特别的,通常不用外科手术介入,也可以达到简便植入体内的目的,主要过程是通过包裹活性材料的水凝胶在目标部位构成凝胶,减缓药物的释放,增加药物的代谢时长,整个疗程简便,降低了患者的损伤,减少了治病的费用[21]。同样地,在药效明显加强的同时,其不良反应相应地减少。因此,作为新型的药物相关输送体系,可注射性水凝胶体系正逐渐受到更多的关注。PLGA-PEG-PLGA聚合物属于天然的高分子聚合物,其具有许多特性包括降解性优异、无毒无害、生物兼容性强等,并且作为活性载体,其能增加成分的稳定性,改变用药的方式,加快药物的吸收,提高生物利用度,从而达到靶向治疗和控制释放的目的[22]。本论文设计的PLGA-PEG-PLGA聚合物可以充分包裹雷帕霉素,通过不断临床应用中可以逐步调控释放雷帕霉素的速率,控制浓度维持在最低和极限之间,增加其相关代谢的时长,减轻其副作用和毒性,并降低药物使用次数。其适合范围还包括术后肿瘤周围的组织注射用药,对癌细胞有着抑制其再生的作用,大大减少肿瘤复发的概率。另外,肿瘤内注射也是可行的,可以靶向用药,降低不良反应,从而达到控制癌症治疗的目的。本课题旨在探讨雷帕霉素凝胶注射剂抑制神经母细胞瘤细胞和动物移植瘤模型的作用。此次研究共分为三个部分:首先证实了在神经母细胞瘤的生长及增殖过程中,雷帕霉素抑制效果显著,其次以温度敏感性PLGA-PEG-PLGA聚合物为基础,雷帕霉素为模型药物,制备了雷帕霉素凝胶注射剂,仔细研究了该制剂的理化性质相关表征和在体外释放的相应状况,最后通过体内实验来证实,该种类型制剂的毒副作用少,其具有优异的抑制肿瘤活性,属于相对有效而安全的抗肿瘤制剂。并且此次研究还可以作为方法和依据,不仅仅是在其他相关肿瘤的化疗和生物治疗方面,也是将来在靶向药物的关于控释系统的设计方面和理论资料方面。本研究的主要内容及结构如下图:研究方法:第一部分:雷帕霉素对神经母细胞瘤细胞生物学的影响通过不同浓度的雷帕霉素干预神经母细胞瘤SK-N-SH和SH-SY5Y细胞,利用CCK-8试验检测雷帕霉素对神经母细胞瘤SK-N-SH和SH-SY5Y细胞增殖能力的影响;使用流式细胞仪查验雷帕霉素在肿瘤细胞周期的作用;使用电镜观察并分析神经母细胞瘤形态学及细胞学上的改变;Westen Blot检测雷帕霉素处理后SK-N-SH和SH-SY5Y细胞自噬相关蛋白的表达情况。本试验主要的目的是明确在神经母细胞瘤的细胞增殖过程及自噬过程中,雷帕霉素产生的效果及影响机制。第二部分:雷帕霉素凝胶注射剂的构建及表征制备PLGA-PEG-PLGA雷帕霉素凝胶,充分研究并记录了制剂制备的表征、粘度性质和相转变的温度,同时使用高效率的液相色谱法测定凝胶对雷帕霉素的包封率及载药量。第三部分:雷帕霉素凝胶注射剂对神经母细胞瘤的影响通过培养神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立神经母细胞瘤裸鼠移植瘤模型,予瘤内注射雷帕霉素凝胶注射剂,之后通过观察一系列裸鼠的行为反应、肿瘤体积的变化、相关标本切片的病理等,来探究该种制剂在动物体内抗肿瘤活性性能,并逐步探讨药物相关的毒副作用和体内安全性。研究结果:1.雷帕霉素能对神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和SH-SY5Y细胞的增殖过程起到相对明显的抑制作用,这种作用存在着一定的时间浓度依赖性,并可以将细胞周期阻滞于GO/G1。电镜可以观察到细胞胞浆内出现自噬囊泡。同时雷帕霉素能通过介导mTOR信号通路诱导SK-N-SH和SH-SY5Y细胞自噬,主要通过mTOR,Beclin-1,p62,LC3I/II多蛋白共同作用调控其自噬发生发展。2.成功构建了负载雷帕霉素PLGA-PEG-PLGA凝胶注射剂,具有较好的载药和释药特性。3.雷帕霉素凝胶注射剂可以有效提高雷帕霉素在体内的代谢时长,具有长效抗肿瘤的功能,提高抑制肿瘤活性的效果,同时未见有明显的脏器毒性反应,具有很好的安全性。研究结论:1.在神经母细胞瘤的增殖过程及自噬过程中,雷帕霉素有着阻滞的效果,其机制可能与mTOR信号通路相关。2.雷帕霉素凝胶注射剂可以抑制神经母细胞瘤的生长,且该制剂在抗肿瘤方面性能良好,毒副作用相对较小,可以作为有效而安全的抗肿瘤制剂。