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目的 观察与鉴定用RPMI-1640-40特定培养基对日本血吸虫30d成虫全细胞体外培养的效果；体外培养获得血吸虫童虫传代细胞和重组技术构建血吸虫铁蛋白DNA疫苗(proVAX-GMCSF-SjFer)进行联合免疫观察其保护性效果。
方法 用RPMI-1640-40特定培养基对日本血吸虫尾蚴感染小鼠30d成虫全细胞作体外原代和传代培养；动态观察培养细胞的生长状态、一般形态和冻存复苏后的细胞活力；用细胞计数法测定生长曲线和分裂指数；用碱性磷酸酶(AKP)染色、超微结构观察和染色体核型分析等指标鉴定传代细胞的培养质量。选择日本血吸虫肝门型早期童虫细胞，用RPMI-1640-40特定培养基作体外原代和传代培养，获得第4代培养细胞。从GenBank中查找日本血吸虫铁蛋白与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的基因编码序列，设计含有EcoRI和NotI酶切位点引物，在已构建好的pGMC／SjFer重组质粒上扩增GMCSF-sjFer基因，产物经双酶切回收后定向克隆到真核表达载体proVAX中，经PCR和双酶切鉴定阳性克隆，构建proVAX-GMCSF-sjFer DNA疫苗。童虫培养细胞和DNA疫苗联合免疫的保护性实验设计：选用雌性昆明鼠随机分为A、B、C、D、E 5组，10只／组。A组(O.9％NaCI 100μl／鼠、)；B组(童虫细胞1×10<6>个／鼠)；C组(童虫细胞1×100<6>个和oroVAX-GMCSF-SjFer 100μg／鼠联合免疫)；D组(proVAX-GMCSF-SjFer 100μg／鼠)；E组(proVAX 100μg／鼠)。童虫培养细胞作腹腔接种，质粒DNA作肌肉注射。按0、2、6W设计共接种3次。末次接种后第2W，经腹部感染尾蚴40±2条／鼠。感染后第42d剖杀，计数每鼠虫荷和每克肝卵数。
结果用RPMI-1640-40特定培养基对日本血吸虫30d成虫细胞作体外培养的结果显示：培养细胞呈半悬浮聚集生长状态；原代和传4代内培养细胞以及冻存复苏细胞的存活率在90％以上；培养细胞的一般形态多呈圆形或椭圆形，少数为不规则或多边形及梭形，大小约为3.0～15.5μm×2.5～12.0μm，可见生长旺盛的发亮细胞和成对细胞分裂相；传5代内的细胞生长繁殖速度较快，5代后有所减慢；传5代细胞的染色体符合日本血吸虫的二倍体核型，数目为8对16条；传5代细胞的超微结构既显示有形态结构正常的4类细胞，也显示出至少3种异常形态的细胞。DNA疫苗构建结果显示：对重组质粒proVAX-GMCSF-SjFer进行PCR和双酶切，获得一条大小约为960bp的目的片段和两条酶切片段。保护性免疫结果显示：童虫培养细胞组与对照组相比，减虫率和减卵率分别为35.71％和46.85％；proVAX-GMCSF-SjFer组与proVAX组比，减虫率和减卵率分别为22.46％和29.40％；童虫细胞与proVAX-GMCSF-SjFer联合免疫组与对照组相比仅获得29.00％的减虫率和35.53％的肝卵减少率；在B、C和D组均检测到抗血吸虫抗体，其中B组的抗体水平为最高。
结论 用RPMI-1640-40血吸虫特定培养基对日本血吸虫30d成虫全细胞体外培养获得部分细胞传代成功；成功地构建了日本血吸虫铁蛋白(SjFer)与细胞因子GM-CSF的DNA疫苗(proVAX-GMCSF-SjFer)；用血吸虫童虫培养细胞和proVAX-GMCSF-SjFer分别接种小鼠均获得一定的保护性免疫力，其中以细胞型疫苗保护性最好，但用两种疫苗联合免疫的效果未能达到进一步改善和提高。