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紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上分布最广的一种多年生豆科牧草，它不仅产量高而且营养丰富，被誉为“牧草之王”。然而反刍动物大量采食后易发生臌胀病，严重限制了这种优良牧草在畜牧业中的利用与营养潜力的发挥。紫花苜蓿中的浓缩单宁（condensedtannins, CT）含量低是引起反刍动物臌胀病的原因，因此适量提高紫花苜蓿中单宁的含量，降低反刍动物臌胀病的发生几率，具有重要的实践意义。本试验主要研究紫花苜蓿浓缩单宁合成途径中的两个重要基因：二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol4-reductase，DFR）和花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR），取得了如下进展：1.以紫花苜蓿荚果为试验材料，采用RT-PCR方法克隆得到紫花苜蓿DFR基因的cDNA序列，该片段开放阅读框1020bp，编码339个氨基酸。序列比对分析发现，所获得的序列与近缘植物的DFR基因序列有较高的相似性，与蒺藜苜蓿达到97%，说明该基因为紫花苜蓿DFR基因，命名为MsDFR，并在Genbank中登陆JF931173。2.通过实时定量的方法揭示MsDFR在不同组织和不同胁迫条件下的表达量。结果表明：MsDFR在荚果中的表达量最高。该基因的表达还受到高盐和干旱胁迫诱导，同时也受到外源激素GA诱导，以及伤害胁迫的诱导。3.构建表达载体pCAMBIA1302-MsDFR-GFP，进行亚细胞定位研究。将质粒用基因枪轰击的方法转入洋葱表皮细胞，结果表明：MsDFR蛋白定位于细胞质中。4.构建表达载体pBI121-MsDFR-GUS，通过农杆菌介导法转化拟南芥，期望得到MsDFR超量表达的转基因植株。经过后代的筛选培养和分子检测，确定MsDFR基因已经整合到拟南芥基因组中。MsDFR转基因植株中的浓缩单宁含量比对照植株有所提高，但是差异并不明显。5.以紫花苜蓿荚果为试验材料，采用RT-PCR方法克隆得到紫花苜蓿ANR的cDNA序列，该片段开放阅读框为1017bp，338个氨基酸。序列比对分析发现，该核苷酸序列与蒺藜苜蓿，三叶草，百脉根，红花菜豆等的ANR基因核苷酸序列有较高的相似性，与蒺藜苜蓿达到95%。由此证实获得的序列是紫花苜蓿ANR基因的全长cDNA序列，命名为MsANR，并在Genbank中登陆HM754630。6. MsANR基因以单拷贝形式存在于紫花苜蓿基因组中，且该基因的DNA序列由六个外显子和五个内含子组成。7.采用染色体步移的方法得到了MsANR基因的启动子序列，包含TATA-box和激活元件CAAT-box。还有光感应元件：ACE、Box-4、BoxI、G-Box、GA-motif、GAG-motif、GT1-motif、Chs-Unit1ml、Sp1和TCT-motif。此外还有脱落酸响应元件ABRE；赤霉素响应元件GARE-motif和TATC-Box；MYB转录因子结合区域；ERF转录因子结合区域；抵御胁迫响应元件TC-rich repeats和抗氧化元件ARE。8.通过实时定量的方法揭示MsANR在不同组织和不同胁迫条件下的表达量。结果表明：MsDFR在荚果中的表达量最高。该基因的表达量也受到高盐和干旱胁迫诱导，同时受到外源激素ABA和GA诱导，以及伤害和黑暗条件胁迫的诱导。9.构建表达载体pCAMBIA1302-MsANR-GFP，进行亚细胞定位研究。采用PEG融合的方法转入拟南芥原生质体，用激光共聚焦显微镜观察结果表明，MsANR蛋白定位于细胞核和细胞质中。10.将含有完整开放阅读框的MsANR基因片段插入pET-30a(+)构建了原核表达载体pET30a-ANR，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明该融合蛋白能高效表达。11.将构建的表达载体pCAMBIA1302-MsANR-GFP，通过农杆菌介导法转化拟南芥，期望得到MsANR超量表达的转基因植株。经过后代植株的筛选培养和分子检测，确定MsANR基因已经整合到拟南芥基因组中。浓缩单宁的含量检测表明：转基因植株单宁含量显著高于对照植株。说明外源ANR基因的导入可能参与植物内源浓缩单宁的代谢合成，MsANR基因在单宁合成途径中起着极为重要的作用。