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目的:本研究通过建立大鼠脊髓损伤模型,研究哈巴苷对大鼠脊髓损伤的保护作用,并探讨其脊髓保护作用的机制,为哈巴苷在防治脊髓损伤疾病中的应用提供实验基础,并可能在未来SCI治疗中具有潜在研究价值。材料与方法:1.动物分组:成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠(190-230g)购自南京医科大学动物中心。将大鼠在SPF实验室动物中心饲养,恒定环境为23±0.5℃,交替12小时明暗循环。将大鼠随机分为三组:对照组、SCI组、哈巴苷。SCI组和哈巴苷组于脊髓损伤后1小时通过腹腔内注射,分别给与生理盐水和哈巴苷,然后每天一次,持续2天。2.脊髓损伤模型制备:采用改良Allen法建立大鼠急性脊髓损伤模型。3.采用国际常用的Basso-Beattie-Bresna han(BBB)评分法评估大鼠运动功能:评分前先排空大鼠的膀胱,然后将大鼠放置于地面上,观察记录其后肢的行走及肢体活动。术前及术后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d及42d进行评分,满分21分,后肢全瘫为0分。评定时间为上午固定时间开始,采用双盲法,由经培训后的2人分别独立完成。4.原代神经元培养:选用出生后1d内的SD新生鼠,浸入75%乙醇中,背部切开皮肤和软骨,分离脊髓,培养观察,7天后通过用抗微管相关蛋白MAP-2和Neu N的抗体来评估神经元培养物的纯度。5.细胞活力测定:用细胞计数试剂盒CCK-8评估细胞活力6.细胞凋亡检测:在用谷氨酸钠处理24小时后,将神经元与或不与哈巴苷(50um/L)一起孵育。进行流式细胞术以验证荧光显微镜的体外结果7.蛋白质印迹分析:提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度8.组织准备:将大鼠用致死剂量的水合氯醛腹腔麻醉,分离完整脊髓,处理后切片、储存使用.9.原位凋亡分析-Tunel染色:损伤后第7、28天脊髓凋亡细胞按制造商的程序用TUNEL进行鉴定和量化,获取图像,用绿色荧光对凋亡细胞核进行表征。10.脊髓组织免疫荧光11.使用SPSS17.0统计软件进行分析,结果表示为均值±标准差。各组间差异采用单因素方差分析,随后进行Bonferroni的事后检验。结果:1.与SCI组相比,哈巴苷组BBB评分持续且显著升高(p<0.05),提示哈巴苷处理改善脊髓损伤后的运动功能恢复。2.Neun染色显示出哈巴苷组大鼠前角的运动神经元数量大于SCI组大鼠的运动神经元数量,提示哈巴苷增加脊髓损伤后运动神经元的存活率,减少病变大小。3.SCI组中的TUNEL阳性神经元细胞数量多于对照组。然而,在哈巴苷组中,TUNEL阳性神经元细胞的比例比SCI组显著降低,提示哈巴苷对脊髓损伤大鼠神经元的保护。4.哈巴苷组病变区域中NF200染色的减少及GFAP染色的增加比SCI组低得多,表明哈巴苷的给药显著促进了SCI后的轴突再生及抑制胶质疤痕产生。5.Western blot结果显示,与对照组和SCI组相比,哈巴苷处理的大鼠脊髓神经元中β-catenin蛋白水平显着增高。此外,哈巴苷在SCI后14天显著增强c-myc和cyclin D1蛋白的表达。这些结果表明SCI后哈巴苷能够激活脊髓神经元中Wnt/β-catenin信号通路。6.随着哈巴苷浓度的增加,细胞活力降低。100μM的浓度显示出比其他浓度显着更高的细胞毒性(P<0.05)。7.哈巴苷在体外可以减少神经元细胞的死亡.8抑制Wnt/β-catenin信号通路降低哈巴苷在原发性脊髓神经元的抗凋亡作用.结论:脊髓损伤后给予大鼠哈巴苷能提高脊髓神经元中β-catenin、c-myc和cyclin d1蛋白的表达水平,增加运动神经元的数量,缩小脊髓损伤区的大小。此外,在脊髓损伤后给予哈巴苷治疗也降低了促凋亡蛋白bax和cleaved caspase-3的蛋白表达水平和免疫染色细胞数,抗凋亡蛋白bcl-2的表达水平也有所提高。当Wnt/β-catenin信号通路被抑制时,观察到哈巴苷的抗凋亡作用减弱。此外,应用哈巴苷可增加NF200染色,减少脊髓损伤部位的GFAP染色。综上所述,我们的研究表明,哈巴苷可能是治疗脊髓损伤的一种有前瞻性的药物。