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研究背景:重组人骨形态发生蛋白2（Recombinant human bone morphogenetic protein 2,rhBMP2）的成骨潜能在骨组织工程中已得到广泛认可。然而,由于rhBMP2半衰期短、超生理剂量的问题造成已产生令人担忧的并发症,如术后炎症和相关的副作用。特别是,rhBMP2已被证明能增强破骨细胞生成,从而导致临床并发症,如骨溶解等。近年来,BMP2抗体被认为有望取代rhBMP2,被称为抗体介导的骨再生（Antibody mediated osseous regeneration,AMOR）。尽管研究证明了其骨诱导能力,但特异性BMP2抗体的潜在成骨机制和不良反应尚未阐明,这使得优化抗体并实现应用变得困难。目的:1.研究BMP2免疫复合物在体内成骨的潜能;2.探究BMP2免疫复合物在体外诱导破骨细胞分化的作用能力;3.初步探索其调节破骨细胞分化的信号通路及在共培养体系中成骨诱导、破骨诱导潜能分析,对BMP2免疫复合物的潜在成骨机制提供相应的理论基础及思路。方法:1.为减少内源性BMPs的影响,预先在体外建立了BMP2免疫复合物（BMP2-immune complex,BMP2-IC）,将其分别引入异位成骨模型和原位成骨模型观察成骨潜能。主要对异位成骨模型通过红外散斑成像分析血流灌注情况,Micro-CT扫描重建及Masson染色分析骨再生情况;对原位成骨模型进行Micro-CT扫描重建、HE染色及TRAP染色。2.用BMP2-IC或rhBMP2等诱导原代巨噬细胞向破骨细胞分化,通过TRAP染色及骨吸收实验分析破骨细胞的数量、成熟度及骨吸收活性;进一步通过细胞免疫荧光观察破骨细胞形态及组织蛋白酶K（Cathepsin K,CTSK）的表达情况;通过RT-PCR检测破骨细胞相关基因（NFATc-1,CTSK,MMP-9,DC-STAMP）的表达分析。3.首先通过使用拮抗剂（Noggin或抗FcγR抗体）封闭BMP2受体及FcγR受体来分析BMP2-IC内部的BMP2结构域和Fc结构域对破骨细胞分化的影响。然后采用共培养模式分析潜在的机制。首先通过TRAP染色,骨吸收实验观察破骨细胞的数量、成熟度和骨吸收活性,进一步采用Western blot分析下游蛋白（p-PLCγ2、PLCγ2和NFATc-1）的表达情况,然后通过细胞免疫荧光进一步验证。MC373-E1与RAW264.7共培养,通过茜素红染色及TRAP染色观察分析BMP2-IC在共培养体系中成骨诱导及破骨诱导潜能。结果:1.在异位成骨模型中,血流灌注分析,3G7+MSC组和IC+MSC组比MSC组钙化团块的血流灌注明显增多,而BMP2+MSC组几乎检测不到血流灌注。Micro-CT结果显示3G7+MSC、BMP2+MSC、IC+MSC组的矿化量明显增加,但三个组之间的矿化量无明显差异。Masson染色结果显示3G7+MSC组和BMP2+MSC组新骨生成能力低于IC+MSC组,但两组之间无明显差异。在原位成骨模型中,Micro-CT结果显示Control组的牙槽窝在2周后显示低密度影及部分骨愈合,然而3G7、BMP2、IC组牙槽窝显示出高密度影和完全骨愈合。HE染色显示3G7、IC组牙槽窝内形成的矿化结节是由矿化的微球和新生骨组成,而BMP2组是由矿化微球组成。TRAP染色结果:BMP2组相比Control组诱导了更多数量的破骨细胞,而3G7组和IC组抑制了破骨细胞的生成。2.TRAP染色和骨吸收实验显示,在破骨细胞的数量、成熟度、骨吸收方面,BMP2-IC组促进破骨前体细胞分化的能力均明显低于BMP2组。RT-PCR结果进一步显示BMP2-IC组表达NFATc-1、CTSK、MMP-9、DC-STAMP m RNA的水平明显低于BMP2组,同样,后续的细胞免疫荧光实验进行进一步验证得到了相似的结果。3.TRAP染色和骨吸收实验显示,相对于IC组,IC+Nog组的破骨细胞的分化及骨吸收功能两者无明显差异,而IC+Fc R Ab组,破骨细胞的分化及骨吸收功能受到抑制,且具有统计学意义。Western blot显示从第0天到第2天,FcγRⅡ/Ⅲ的高表达,然后从第3天到第7天显著下降。对p-PLCγ2进行免疫荧光染色发现,在第2天的时候,BMP2-IC组和NS-IC诱导的破骨细胞出现了强染色,在第7天的时候,以上两组破骨细胞内表达减弱。Western blot显示BMP2、BMP2-IC和NS-IC组的NFATc-1蛋白表达均高于对照组,我们观察到PLCγ2在BMP2-IC或NS-IC诱导的破骨细胞中过度表达。在直接共培养体系中,BMP2-IC显著增加了矿化量,但IC+Nog组Noggin的拮抗作用将其降低到与其他组一样的水平。BMP2-IC组减少破骨细胞数量和每个细胞的细胞核数量。在间接共培养中,所有组别在矿化量和破骨细胞诱导方面无明显差异。结论:1.体内诱导新骨形成方面,BMP2-IC优于rhBMP2和BMP2抗体。2.BMP2-IC在体外能够促进破骨细胞分化（破骨细胞的数量、分化程度、骨吸收活性）,但是其潜能明显低于rhBMP2。3.BMP2-IC通过Fc端结构域结合FcγR激活诱导破骨细胞分化,结合之前的研究结果可以得出BMP2-IC通过不同的功能结构域与成骨细胞和破骨细胞前体反应。4.BMP2-IC通过促进成骨细胞分化同时抑制破骨细胞生成来促进骨再生,其机制可能依赖于破骨细胞和成骨细胞之间的直接细胞接触,而不是旁分泌细胞通讯。因此本实验为特异性抗体介导骨再生的机制提供了一定的理论基础及思路。