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研究目的:肝星状细胞(HSCs)和肝内胆管增生在胆道闭锁(BA)肝纤维化进程中起重要作用。微小RNA(mi RNAs)为约22个核苷酸长度的小分子,其异常表达往往与多种疾病的发病进程密切相关。我们近来研究显示mi R-200家族在BA肝纤维化组织中表达显著升高,而mi R-124表达量却明显下降,但是我们并不清楚这些mi RNAs在BA肝纤维化进程中的作用和分子机制。本研究将首先探索mi R-200b在HSCs激活中的具体功能和机制。紧接着将在体内外实验中研究mi R-124对胆管增生的作用,探讨mi R-124影响胆管增生的分子机制。肝内胆汁淤积是HSCs激活和胆管增生重要诱因。临床治疗显示糖皮质激素(GCs)辅助治疗似乎对胆汁清除有益,但其治疗效果仍存在争议。本研究最后研究了GCs对胆汁酸体内代谢的具体功能和分子机制。研究方法:利用细胞划痕实验及Transwell迁移实验检测HSCs的迁移活动。利用蛋白印记及免疫组化等实验技术检测IL-6、Foxa2、磷酸化STAT3等蛋白在BA患儿和胆管结扎(BDL)大鼠肝组织中的表达水平。通过mi RNA芯片及定量PCR实验检测mi RNAs在BA患儿和BDL大鼠肝组织中的表达变化。运用蛋白印记、细胞迁移、细胞增殖等实验研究mi RNAs的生物学功能。双荧光素酶报告系统和蛋白印记实验用来检测和验证mi RNAs靶基因。药物缓释泵用于对正常状态大鼠及BDL大鼠持续给药7天。利用定量PCR和蛋白印记实验在BA患儿及大鼠组织中检测FOXA2、GR和胆汁酸代谢相关基因的表达。运用荧光素酶报告载体检测启动子的活性。研究结果:实验结果显示mi R-200b在BA患儿的肝组织中表达量增加且随肝纤维的加重而升高。体外过表达mi R-200b能显著地促进肝星状细胞LX-2增殖和迁移,与此同时,mi R-200b表达激活了PI3K/Akt信号通路。FOG2可直接通过结合p85α抑制PI3K/Akt信号通路激活。实验结果进一步显示过表达mi R-200b可显著降低LX-2细胞内的FOG2蛋白表达。利用si RNA敲除FOG2后发现PI3K/Akt信号通路被激活,进而引起了LX-2细胞的增殖和迁移,这种效应与过表达mi R-200b所起的作用一致。与此相反,利用PI3K抑制子LY294002则能有效地阻止mi R-200b的促Akt磷酸化效果。我们接下来研究发现IL-6的表达水平在BA患儿及BDL大鼠肝组织、血清中均显著升高,而mi R-124的表达量却明显降低。相关性分析结果显示基因IL-6R与STAT3的m RNA表达水平均与mi R-124表达水平显著负相关。mi R-124可通过靶向结合IL-6R与STAT3基因的3端非编码区下调IL-6R与STAT3基因的表达水平。体内外实验表明过表达mi R-124可有效地抑制IL-6介导的胆管增生。实验结果进一步显示mi R-200s家族在BA患儿及BDL大鼠肝组织中显著升高,过表达mi R-200s可以通过抑制FOXA2基因表达,促进IL-6分泌。最后我们研究发现GCs处理大鼠会破坏胆汁酸的系统平衡,升高血浆中胆汁酸含量而减少了胆汁酸随粪便排出。GCs可通过上调回肠末端钠依赖性胆汁酸转运体Asbt表达量增加肠道对胆汁酸的吸收。与此同时,GCs处理通过上调肝细胞基底膜上的胆汁酸转运体Ntcp增加肝细胞对门静脉中胆汁酸的回收。GCs处理还可以通过抑制胆汁酸合成限速酶Cyp7a1的表达抑制胆汁酸从头合成。综上所述,GCs放大了胆汁酸肠肝循环,因此,GCs在治疗BA时应注意监测血浆中胆汁酸的变化。实验结论:研究结果显示mi R-200b表达水平随BA患儿肝纤维化加重而升高,提示mi R-200b可作为监测BA肝纤维进程的一个潜在标志物。mi R-200b可通过下调靶基因FOG2激活Akt进而引起肝星状细胞增殖和迁移,从这个意义上可以说mi R-200b可作为一个肝星状细胞激活的指标。实验结果提示mi R-124是通过阻滞IL-6/STAT3信号通路来抑制体内外胆管增殖,其可能会成为影响BA肝纤维化的一个靶标。结果同样显示在胆汁淤积肝组织中FOXA2减少可能是IL-6R/STAT3信号通路激活的原因之一。最后研究显示GCs处理可以放大胆汁酸的肠肝循环,提示GCs治疗BA时对胆汁及黄疸清除作用有限。