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视网膜色素变性是导致视力丧失的主要疾病之一,在全世界的发病率约为1/4000-1/3500。我们实验室发现并建立了一种患有视网膜色素变性疾病的近交系小鼠（rdf小鼠,现已繁殖到F18代）。该小鼠遗传方式为常染色体隐性遗传,视网膜电图检测表现为成年时a、b波消失,且具有发病早、进展快的特点,是人类视网膜色素变性的一种良好的疾病动物模型。本课题研究目的为对这种视网膜退行性变小鼠的致病基因进行鉴定。方法1.选择一些常见的视网膜色素变性致病基因为候选基因,通过检测其在rdf小鼠视网膜中的表达水平进行致病基因的筛选。2.对于表达异常的基因进行结构分析,采用特异性引物对候选致病基因进行基因组扩增、基因型分析,并对扩增序列进行测定和分析。3.分别建立患病小鼠与野生昆明小鼠、C57BL/6J小鼠的杂交品系,分析视网膜退行性变与突变基因的关系,检测突变基因在杂交系中的遗传特点。4.观察突变基因在同类系小鼠中的遗传特点及与视网膜退行性变的关系。5.观察突变基因在rdf小鼠中mRNA表达的水平以及表达产物的结构分析。结果1.通过反转录聚合酶链式反应比较候选基因在不同小鼠视网膜中的表达情况,发现编码磷酸二酯酶β亚单位的pde6b基因在成年rdf小鼠视网膜中没有表达,在出生后7天的小鼠中表达水平相对于相同年龄的野生型小鼠显著降低。2.设计引物对筛选到的rdf小鼠候选致病基因进行基因组扩增并分析得到的序列,发现rdf小鼠的pde6b基因第一个内含子区存在一个逆转录病毒样的插入序列（LTR序列）。RT-PCR检测到逆转录病毒env基因的表达,序列分析表明该序列位于小鼠第5号染色体pde6b基因的第一个内含子上,与xmv逆转录病毒的env序列具有100%的同源性。通过基因特异性引物进行PCR扩增基因组片段并进行序列测定将该插入序列的插入位置确定为pde6b第一个内含子1505bp处。3.将rdf小鼠分别与野生型昆明小鼠和C57BL/6J小鼠杂交,然后将其子一代进行互交和将子一代与患病亲代进行回交以收集杂交二代和回交小鼠。得到F1代小鼠10只,F2代小鼠61只,N2代小鼠60只。所有小鼠都经视觉电生理技术进行检测确定其表型。基因型分析发现这种插入突变等位基因与视网膜退行性变共分离。对于基因型确定为杂合状态的杂交二代小鼠进行互交得到F3代小鼠53只,其表型与该插入突变等位基因也表现出共分离的特点。4.将致病基因导入到C57BL/6J小鼠中,对其家系进行表型鉴定和基因型分析,发现候选致病基因在同类系小鼠中稳定遗传、与视网膜退行性变有直接关系。5.克隆并测序了正常昆明小鼠以及rdf小鼠pde6b基因的编码区全长,发现昆明小鼠pde6b基因的编码区与GeneBank中参考序列（NM008806）有两个位点差异:昆明小鼠第706位碱基为A,而数据库中序列为G;第1149位碱基前者为T,后者为C。rdf小鼠pde6b基因的编码区序列与野生昆明小鼠类似。结论该研究从遗传学角度证实了本实验室的rdf小鼠致病基因为pde6b基因,pde6b基因第1个内含子1505bp位点处的一个逆转录病毒的插入导致了缺陷基因的形成,插入突变等位基因的纯合表达造成视网膜退行性变发生。