目前,纤维素酶的成本高、酶解效率较低是限制大规模纤维素乙醇工业化发展的主要因素之一。β-木糖苷酶是木聚糖降解酶系中的关键组分,在木质纤维素的酶解过程中,它能有效地降解木聚糖酶的水解的中间体-低聚木糖,缓解其对木聚糖酶和纤维素酶酶活性的抑制,促进纤维素酶系对木质纤维素材料的水解,减少生物转化的酶用量。因此,β-木糖苷酶已被公认为是纤维素酶系的核心酶之一。然而β-木糖苷酶在大部分丝状真菌产生的木质纤维素降解酶系中酶活力较低,目前仍缺乏高产β-木糖苷酶的纤维素酶菌株用于工业化生产,主要通过额外添加β-木糖苷酶或通过酿酒酵母菌株中异源表达β-木糖苷酶等措施,来弥补糖化发酵过程中β-木糖苷酶活力不足。但目前国内关于β-木糖苷酶资源的报道也极为有限,无法满足对β-木糖苷酶的应用需求。因此,继续挖掘具有优良性质,例如:高效的催化效率、良好的热稳定性、较高的单糖耐受性及与木聚糖酶较好的协同性等的β-木糖苷酶,不仅可以丰富国内的β-木糖苷酶资源,而且对优化纤维素酶系及构建具有高β-木糖苷酶活力的纤维素酶生产菌株也具有重要意义。草酸青霉作为纤维素酶的工业生产菌株,与里氏木霉相比,具有酶系组成及比例更加完善、半纤维素酶系比较完整等优势,尤其是酶系中木糖苷酶的种类较多。但目前经遗传改造后的草酸青霉纤维素酶高产菌株虽然可以高效表达纤维素酶和木聚糖酶,但β-木糖苷酶的胞外分泌量较少,影响了纤维素酶降解木质纤维素的效率,导致生物转化过程中纤维素酶用量和用酶成本增加。基于以上背景,本论文在草酸青霉木糖苷酶的资源挖掘及其功能研究、高产β-木糖苷酶的纤维素酶菌株的构建等方面开展了较为系统的研究,主要研究内容和结果如下:1.草酸青霉木糖苷酶的异源表达及应用潜力评价成功地克隆7个木糖苷酶编码基因并实现了在毕赤酵母中的异源表达,得到了正确的重组菌株。SDS-PAGE结果表明:重组酶蛋白例如GH43家族的Xyl43A、Xyl43C、Xyl43B与Abf43D等能够在毕赤酵母中有效分泌表达,但GH3家族的Xyl3C和Xyl3D以及GH31家族的Xyl31A的胞外酶蛋白分泌量甚少。酶学性质研究表明Xyl31A和Xyl43A为β-葡萄糖苷酶;Xyl3D为多功能β-葡萄糖苷酶/β-木糖苷酶/α-阿拉伯呋喃糖苷酶,其中β-葡萄糖苷酶的酶活性最高;Abf43D是双功能β-木糖苷酶/α-阿拉伯呋喃糖苷酶;Xyl43B为偏碱性的β-木糖苷酶。利用上述表达的糖苷酶,以及前期表达的GH3家族β-木糖苷酶Xyl3A,进行酶解实验结果表明,在pH 4.8条件下,添加Xyl3A、Xyl3D和Abf43D能有效促进木聚糖酶对木聚糖的水解,特别是Xyl3A;而Xyl43B与木聚糖酶混合在pH 7.0条件下降解木聚糖,可使木糖产量提高约9倍。2.β-木糖苷酶Xyl43B和Abf43D的酶学性质及与木聚糖酶协同作用研究通过不同浓度梯度的抗性筛选,分别获得了高产β-木糖苷酶Xyl43B和Abf43D的重组菌株,两株菌株胞外分泌蛋白的浓度分别达到92.8 mg/L和65.8 mg/L,都远远高于已报道的酵母表达GH43β-木糖苷酶的产量(0.22mg/L)。通过研究纯酶Xyl43B的酶学性质,发现该酶仅具有β-木糖苷酶活性,最适反应pH为7.0,在pH 6.0-8.0范围内保持较高催化活性。而Abf43D是一个双功能酶,同时具有β-木糖苷酶活性和α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性,在pH 4.0-6.0范围内保持60%以上的酶活力。纯酶Abf43D和Xyl43B的Ki值分别为35.77mM和28.09 mM,都表现出了较高的木糖耐受性,有利于在酶解过程中获得较高浓度的木糖。动力学参数分析表明Xyl43B和Abf43D对底物的亲和力要高于大部分报道的β-木糖苷酶。利用不同来源的纯木聚糖和碱性预处理的玉米秸秆为底物进行酶解实验结果表明,利用重组菌株生产的Abf43D和Xyl43B,可有效促进木聚糖底物的水解和碱预处理玉米秸秆原料中半纤维素的降解,提高木糖得率,表现出与木聚糖酶良好的协同作用。其中Abf43D还可以促进碱预处理玉米秸秆半纤维素中阿拉伯糖侧链的降解。上述研究预示Abf43D和Xyl43B具有良好的工业化应用潜力。3.高产β-木糖苷酶Xyl3A的纤维素酶生产菌株构建及在纤维底物糖化发磨中的应用研究分别利用构巢曲霉来源的组成型启动子gpdA和本源的诱导型启动子,在高产纤维素酶菌株草酸青霉RE-10中过表达β-木糖苷酶Xyl3A,筛选获得的重组菌株RXyl、RGXyl-1和RGXyl-2都能显著地提高发酵液中β-木糖苷酶的产量,特别是利用组成型启动子gpdA表达Xyl3A获得的工程菌株RGXyl-1,在其分泌的胞外纤维素酶系中,β-木糖苷酶活力可达到15.05 ±1.79 IU/mL,与出发菌株RE-10相比,β-木糖苷酶活力提高约29倍。此外,研究还发现,与菌株RE-10相比,重组菌株RGXyl-1、RGXyl-2和RXyl的发酵液的其它酶活力也有增加,Ⅱ其中FPA活性分别提高20.01%、8.43%和18.57%,木聚糖酶酶活性也分别提高16.12%、15.54%和16.83%,原因可能是由于基因xyl3A表达盒随机插入到基因组DNA的不同位置,干扰或破坏了其它基因表达造成的。利用工程菌株RGXyl-1液体发酵生产的粗酶液,代替出发菌株RE-10生产的纤维素酶对两种碱性预处理的秸秆进行半同步糖化发酵,发现可以显著降低反应体系中木二糖的浓度,在糖化发酵过程中木二糖浓度一直小于1 mg/mL,同时还可以提高纤维二糖降解速率,有效提高了糖化发酵过程中碱预处理秸秆原料的纤维素转化率和木聚糖转化率,使纤维素乙醇产量分别提高了 26.27%和31.91%。与工业化的纤维素酶生产菌株草酸青霉RE-10相比,构建的工程菌株RGXyl-1发酵生产的粗酶液具有更高的β-木糖苷酶活力、高的FPA和木聚糖酶活力,可有效弥补纤维素酶系中β-木糖苷酶的不足,避免了外源的添加,提高纤维素酶对底物的降解效率和纤维素乙醇产量,因此可有效降低纤维素乙醇生产过程中的酶用量和生产成本,同时有利于减少过程操作步骤,降低酶解工艺的复杂性。4.β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的共表达及在纤维底物糖化发酵中的应用研究β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶都是纤维素酶系中的重要酶类,在木质纤维素原料的半纤维素和纤维素彻底降解生成可发酵糖的过程中起关键作用。为了同时提高二者在纤维素酶系中的含量,利用Red/ET重组技术,成功地构建了大片段的β-木糖苷酶Xyl3A(或Xyl3A与Abf43D)和β-葡萄糖苷酶(Bgl1)基因的共表达盒,并通过转化筛选得到了Bgl1和Xyl3A共表达的工程菌株RXB-2和RXB-3,以及Abf43D、Bgl1和Xyl3A三基因共表达的重组菌株RAXB-1、RAXB-3和RAXB-4。酶活力测定发现上述5株重组菌株发酵液中的纤维素酶、β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活性都得到了不同程度的提高。其中,与出发菌株RE-10的发酵液相比,在发酵6 d时工程菌株RXB-2发酵液的β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的酶活力分别提高11倍和6倍,工程菌株RAXB-4发酵液的β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的活力分别提高20倍和11倍,同时,工程菌株RXB-2和RAXB-4的发酵液滤纸酶活力也分别比RE-10提高了33.3%和52.1%。此外,重组菌株RAXB-1、RAXB-3与RAXB-4发酵液中的α-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活力也分别比RE-10提高了28.4%、60.1%%和36.1%。通过对不同糖苷酶基因的共表达,可以同时实现提高多个所需目的蛋白在酶系中的含量,优化纤维素酶系的目的,同时,还可以避免逐步进行单一组分表达的过程繁琐等缺点。利用不同工程菌株的粗酶液对碱预处理玉米秸秆进行糖化发酵实验,结果表明,与出发菌株RE-10、工程菌株RGXyl-1(RE-10菌株中过表达Xyl3A)和RBB1-10(RE-10菌株中过表达Bgl1)等的粗酶液相比,共表达工程菌株RAXB-4和RXB-2的粗酶液,由于其纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的活力增加,在碱预处理秸秆半同步糖化发酵生产乙醇过程中,有效地消除了纤维二糖和木寡糖在糖化过程中的大量积累,提高了纤维素酶的降解效率,提高了碱预处理秸秆中纤维素和木聚糖的转化率,提高了发酵后乙醇产量,降低了纤维素酶用量。5.多功能糖苷酶Gax3A的酶学性质及对纤维素酶解的促进作用研究在成功实现草酸青霉木糖苷酶Xyl3D在毕赤酵母中异源表达的基础上,通过底物特异性分析证明该酶是一个多功能酶,同时具有β-葡萄糖苷酶/β-木糖苷酶/α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性。由于目前大多数商业纤维素酶制剂中上述三种酶的活性都相对较低。因此,该酶在优化纤维素酶系时,无疑比单功能酶更具有优势。为了进一步研究该多功能酶的酶学性质,促进其应用,进一步在草酸青霉中实现了该基因的同源表达,并利用分子筛成功地分离纯化得到了纯酶组分。该酶虽然同时具有β-葡萄糖苷酶/β-木糖苷酶/α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性,但以β-葡萄糖苷酶活性为主,因此重新命名该酶为Gax3A。酶学性质研究表明,Gax3A的β-葡萄糖苷酶的比酶活为61.53 IU/mg,β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活力分别为17.94 IU/mg和1.25 IU/mg。Gax3A的最适反应温度为70℃,且在70℃保温30min后,β-葡萄糖苷酶仍然保留53%以上的催化活性,说明Gax3A具有较高的热稳定。Gax3A具有良好的金属离子耐受性,特别是对Fe3+、Zn2+、Mn2+和K+离子。与已报道的大部分多(双)功能酶相比,Gax3A对底物的亲和力高,且催化效率较高。利用亚硫酸盐预处理的麦草和NaOH预处理的玉米秸秆为底物进行的酶解实验表明,Gax3A与纤维素酶RE-10混合后,可以有效提高酶解液中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的得率。与添加单功能β-葡萄糖苷酶Bgl1相比,添加Gax3A不仅促进了纤维素的降解,而且可以促进原料中的半纤维素降解为木糖和阿拉伯糖,从而可用于对草酸青霉的纤维素酶系改良。