【摘 要】
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人类赖以生存的粮食(种子和果实)是植物有性生殖的产物。在被子植物中,成功的有性生殖需要花粉及胚囊的正常发育、花粉管正确靶向胚珠的生长、精卵细胞的融合等一系列事件。一直以来,被子植物有性生殖研究的重点之一是分离参与这些事件的关键基因。近年来,随着农杆菌介导的遗传转化方法的成熟,大量的T-DNA插入突变体已被获得并用于被子植物有性生殖的研究。在本研究中,我们分离并克隆了一个参与生殖过程的基因tef。主
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人类赖以生存的粮食(种子和果实)是植物有性生殖的产物。在被子植物中,成功的有性生殖需要花粉及胚囊的正常发育、花粉管正确靶向胚珠的生长、精卵细胞的融合等一系列事件。一直以来,被子植物有性生殖研究的重点之一是分离参与这些事件的关键基因。近年来,随着农杆菌介导的遗传转化方法的成熟,大量的T-DNA插入突变体已被获得并用于被子植物有性生殖的研究。在本研究中,我们分离并克隆了一个参与生殖过程的基因tef。主要研究内容与结果如下:(1)通过筛选本实验室的转基因种子库,发现一株抗性基因分离比异常的转基因植物。该转基因植物抗性基因在后代的分离比为8.5:1,明显偏离正常的分离比(1:3)。该突变体营养生长、开花等都表现正常,但角果内种子数量少于野生型拟南芥,将该突变体命名为tef。(2)通过TADEA-PCR,克隆到tef的T-DNA在拟南芥染色体中的插入位置。结果表明:其T-DNA插入置换了拟南芥4号染色体上一段包含30000核苷酸左右的片段。该片段包含AT4G02890、AT4G02900、AT4G02910、AT4G02920、AT4G02930、AT4G02940、AT4G02950、AT4G02960八个编码基因。(3)利用PCR的方法测试了该插入位点在自交及杂交后代中的传导率。在自交后代中,该插入位点的传导率为12.95%;在以野生型植物为母本、tef为父本,及以野生型植物为父本、tef为母本的杂交测试中,其传导率分别5.6%和5.4%。并且在后代植物中,始终无法获得tef的纯合突变体,暗示tef是一个纯合致死的基因。(4)为探索tef突变体传导率异常究竟是由哪一个基因缺失所致,我们逐一分析AT4G02890、AT4G02900、AT4G02910、AT4G02920、AT4G02940、AT4G02960所对应的T-DNA突变体在后代中的基因型。结果表明:这些T-DNA突变体都能在自交后代中检测出纯合突变植株,提示这些基因的突变并不是导致tef传导率异常的原因。(5)由于AT4G02950缺乏有效的T-DNA突变体,为验证AT4G02950基因是否为导致tef传导异常的目的基因,我们产生了转基因系Pro AT4G02950:AT4G02950,并通过杂交将其导入至tef植株中。在F2植株中,我们分离了包含有tef背景的Pro AT4G02950:AT4G02950纯合植物,并在F3代植株中测试了tef的传导率。结果显示:tef在F3代中的传导率为8.30%,暗示AT4G02950基因不是导致tef传导异常的目的基因。(6)由于AT4G02930缺乏有效的T-DNA突变体,为探索AT4G02930基因是否为导致tef传导异常的目的基因,我们利用CRISPR/Cas9技术敲除AT4G02930基因,并获得了它的缺失突变体tuf。与野生型植物的杂交实验表明:tuf的传导率分别为4.3%(野生型植物为母本)和4.5%(野生型植物为父本);同时,tuf在自交后代中的传导率为9.1%。tuf的传导率几乎等同于tef的传导率,提示AT4G02930基因的缺失可能是导致tef传导率异常的原因。同时产生了Protuf:tuf-GFP转基因植物,并将其导入了tuf突变体中。实验结果表明:Protuf:tuf-GFP的导入将tuf在F2代植物中的传导率提升至52.50%。基于以上实验结果,我们初步得出结论:tef植株传导异常现象是因为丢失AT4G02930基因所导致的。
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