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目的通过内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)活性分析证明:微量氯化钠(sodium chloride, NaCl)浓度(5～20mmol/L)的升高能够显著抑制eNOS活性,使一氧化氮(nitric oxide, NO)合成减少。通过乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)和钙离子载体A23187(eNOS激活剂)做对照,进一步探讨NaCl抑制eNOS活性的分子机制。方法1.细胞实验:应用原代小牛动脉内皮细胞(primary bovine endothelial cells, BA EC)及表达eNOS或者vector的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO)进行Western Blot及eNOS活性分析。2.排除实验干扰因素:应用等毫摩尔甘露醇代替NaCl培养的BAEC细胞系进行eNOS活性分析、应用BAEC细胞系进行WST染色及3H-L-精氨酸摄取能力实验,排除渗透压、细胞活性改变及3H-L-精氨酸摄取能力改变对实验结果的影响。3.动脉内皮细胞再生分析:应用eNOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-Nitro- L- arginine Methyl Ester, L-NAME)和NaCl分别培养小鼠主动脉环,观察NaCl对小鼠动脉内皮细胞再生的影响。4.延伸实验:分别用Ach、Ach加NaCl、A23187、A23187加NaCl培养的细胞分析eNOS活性,进一步探讨NaCl抑制eNOS活性的分子机制。结果1.通过BAEC、CHO-eNOS、CHO-vector细胞系进行Western Blot显示:CHO-vector细胞系不表达eNOS蛋白,而BAEC和CHO-eNOS细胞系表达eNOS蛋白,说明可以用后两种细胞系进行eNOS活性分析。2.通过应用表达eNOS蛋白的BAEC细胞系和CHO-eNOS细胞系进行eNOS活性分析发现:培养细胞所用的NaCl浓度越高,eNOS活性越低(P<0.0001),NaCl对eNOS活性的抑制呈剂量依赖关系。实验中,NaCl孵育细胞15min就能显著抑制eNOS活性。3.通过应用等毫摩尔甘露醇代替不同浓度NaCl培养细胞进行eNOS活性分析,证明eNOS活性的抑制不是由于加入NaCl后渗透压改变引起的(P>0.05);通过对加NaCl(137～157mmol/L)培养的BAEC细胞系进行WST染色,发现NaCl培养组细胞存活率与PBS培养组相比无显著性差异(P>0.05);通过应用BAEC细胞系进行3H-L-精氨酸摄取能力分析(3H-L-Arginine uptake assay),证明不同浓度NaCl对L-精氨酸进入细胞的量无显著性影响(P>0.05)。4.通过进行动脉内皮细胞再生实验,发现培养液中加入eNOS抑制剂L-NAME后,动脉内皮细胞生长非常缓慢。培养液中加入NaCl的二组细胞同样生长缓慢,尤其是加入的NaCl浓度为20mmol/L的一组,内皮细胞生长状况近似于L-NAME组。5.NaCl抑制eNOS活性的分子机制的研究:发现eNOS激活剂Ach和A23187培养的细胞eNOS活性增强,但是同时加入NaCl培养细胞后,增强的eNOS活性被抑制,并且NaCl浓度越高,对eNOS活性的抑制越显著(P<0.05)。结论1.微量NaCl浓度的升高(5～20mmol/L)就能显著抑制eNOS活性,这种抑制发生的非常迅速(15min内)并且呈剂量依赖关系。eNOS活性降低使NO合成减少,血管收缩,血压升高。2. NaCl对eNOS活性的抑制可能是通过影响Ca2+入胞实现的。