江西蜜柑酚类化合物抗氧化、抗癌、抗衰老活性及作用机理研究

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柑橘属于芸香科柑橘属,是我国重要的农业经济作物之一。柑橘中含有丰富的生物活性物质,对维持人体健康,预防疾病发生具有重要意义。柑橘果肉通常以鲜食、榨汁或加工成罐头进行利用,但同时产生的果皮、果渣等工业废料常被忽视,极大降低了农产品的附加值,造成资源浪费。本课题通过探究柑橘各个部分(皮、肉、渣)的酚类化合物组成与含量、抗氧化性活性、抗人肝癌细胞增殖活性,并通过流式细胞仪分析柑橘提取物对细胞周期、细胞凋亡的影响,在蛋白水平上探究其作用机理。通过动物实验,利用秀丽隐杆线虫衰老模型,研究果肉提取物的抗衰老及其作用机制,为进一步开发相关功能性产品提供理论基础。主要有以下研究结果:(1)柑橘果皮、果肉及果渣都具有抗氧化活性,不同部位的活性差异较大。果皮中维生素C(45.72±4.01 mg/100 g FW)、总多酚(515.4±33.07 mg GAE/100 g FW)和总黄酮(512.0±10.66 mg CE/100 g FW)含量最高,果肉中含量较低(p<0.05)。通过HPLC法鉴定柑橘各部分酚类化合物组成,结果共得到12种酚类物质包括4种酚酸和8种黄酮,其中橙皮苷含量最高,不同部位的酚类物质种类和含量有较大差异。体外抗氧化活性与总酚含量、总黄酮含量均存在显著正相关性,果皮具有较好的总抗氧化和细胞抗氧化活性。(2)柑橘果皮游离态提取物对人肝癌细胞(Hep G2)的抗增殖活性最好,其EC50值为30.76±1.28 mg/m L。在单个的化合物中,川陈皮素(52.93±3.66μM)、桔皮素(91.38±4.02μM)、橙皮素(106.6±0.6μM)、甜橙黄酮(107.0±7.0μM)和橙皮苷(260.9±24.2μM)等的EC50值较低表现出较强的抗增殖活性。(3)进一步研究果皮游离态提取物抗癌机理。细胞周期的结果表明柑橘果皮游离态提取物可通过将Hep G2细胞阻滞于G0/G1期从而抑制癌细胞增殖;细胞凋亡实验中发现经柑橘果皮游离态提取物处理Hep G2细胞24h后,各实验组细胞的凋亡率明显高于空白对照组并呈现剂量效应。Western blot分析发现柑橘果皮游离态提取物显著下调Cyclin D1与CDK4蛋白的表达水平,且呈现剂量依赖性。综上表明柑橘果皮游离态提取物可通过下调Cyclin D1和CDK4的表达及阻滞G1/G0期进而抑制肝癌细胞增殖作用。(4)利用秀丽隐杆线虫衰老模型研究柑橘提取物的抗衰老活性。结果表明:经柑橘果肉游离态提取物处理,能显著延长野生型秀丽隐杆线虫寿命,相比于对照组平均寿命(20.91±1.60天),最大剂量组平均寿命明显延长至26.38±2.06天,实验组平均寿命提高了10.5-26.2%。柑橘果肉提取物还能提高线虫的应激能力,包括抗热应激、紫外辐照应激及氧化应激(百草枯损伤)等。同时,柑橘提取物延可降低线虫内的脂褐素的含量,提高线虫行动力,但是对生殖能力和身体长度变化的影响不大。此外柑橘提取物可以降低线虫体内的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)的含量,提高超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活力,延缓线虫衰老。(5)在分子水平上进一步对柑橘提取物抗衰老机理进行研究。RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)实验结果表明柑橘提取物能够增加IIS(Insulin/IGF-I signaling pathway)通路上daf-16的表达,下调age-1的表达;增加MAPK(Mitogen-activated protein kinase)通路上skn-1和sek-1的表达,提高线虫应激能力;增加抗氧化酶基因(sod-3和gst-4)的表达,提高线虫对氧自由基的抵抗能力。GR1307、LG333突变株线虫与正常N2线虫株相比,经柑橘提取物处理后,实验组与对照组线虫寿命无统计差异,表明daf-16和skn-1基因是柑橘提取物发挥抗衰老的活性的关键基因。
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