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棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的一种土传维管束真菌性病害,严重影响了棉花产量和质量。新疆棉农为增加收入,长期连作棉花,导致土传病害棉花黄萎病不断加重,目前棉花黄萎病已成为制约新疆棉花高产的重要限制因素,所以棉花黄萎病害是棉农普遍关注的焦点问题。本实验室在从棉田土壤中分离出一株对大丽轮枝菌有拮抗活性的生防菌株,阿萨尔基亚芽孢杆菌TUBP1(B.axarquiensis TUBP1),田间实验生防效果为43%。本论文主要通过gfp基因标记阿萨尔基亚芽孢杆菌,并分析其在棉田根际土壤和棉花植株定殖动态以及其对棉花根际土壤微生态效应。为进一步开发阿萨尔基亚芽孢杆菌作为生防菌奠定理论基础。1.阿萨尔基亚芽孢杆菌gfp基因标记及稳定性检测:通过电转化法将含有gfp基因的质粒pHT-315gfp转化进野生菌株TUBP1,成功获得了转化菌株TUBP1-315gfp,使TUBP1可发出绿色荧光。通过离体和活体实验验证野生阿萨尔基亚芽孢杆菌TUBP1和gfp基因标记后其抗菌活性没有明显改变。2.阿萨尔基亚芽孢杆菌标记定殖规律:将带有荧光标记的阿萨尔基亚芽孢杆菌进行棉花根际土壤和棉花植株定殖规律研究,棉花种子表面消毒并浸泡于荧光标记的阿萨尔基亚芽孢杆菌24小时,进行播种,棉花出叶后用B.axarquiensis TUBP1-315gfp培养液(10~8CFU/mL)喷洒叶面,每隔7天采样(土壤、根、茎、叶片),并用扫描电镜和荧光分光光度计进行定性和定量分析,结果显示荧光标记的阿萨尔基亚芽孢杆菌能定殖于棉花根部和广泛分布在表皮,皮层薄壁组织,细胞间隙,木质部。通过根毛细胞裂缝形成横向根结点,缓慢的迁移从根、茎和叶。定量荧光和流式细胞术(FACS)方法显示,随着接种时间的增加,B.axarquiensis TUBP1-315gfp的数量逐渐减少。而B.axarquiensis TUBP1-315gfp水平在种植后45天仍可检测到。未接种组未检测到荧光信号。因此,B.axarquiensis TUBP1-315gfp表现出从根际土壤到棉花植株不同部位的定殖,尤其是在棉花根部能形成生物膜,定殖数量为根际土壤>根部>茎部>叶片。3.GFP标记的阿萨尔基亚芽孢杆菌对土壤微生态效应的影响:棉花根际土壤接种了GFP标记的阿萨尔基亚芽孢杆菌后,土壤总氮(TN),速效磷(AP),速效钾(AK)与对照组相比明显增加,但是当接种浓度为10 ~8 CFU/mL(T2)和浓度为10 ~100 CFU/mL(T3)时,土壤总氮(TN),速效磷(AP),速效钾(AK)增加量差异不显著。除此之外,对土壤中多酚氧化酶(PPO),多酚氧化酶(ALPT),蔗糖酶(SC),脲酶(UE),和碱性磷酸酶(AKP)的酶活在不同生育期都有不同程度提高,尤其是蔗糖酶(SC),脲酶(UE)增加明显。多样性指数Chao和Shannon表明,根部接种生防菌B.axarquiensis TUBP1-315gfp后,根据方差分析结果可知,棉花苗期和蕾期根际土壤微生群落结构和多样性发生显著变化,但对棉花花铃期和吐絮期微生物群落结构和多样性影响不大,说明接种B.axarquiensis TUBP1-315gfp菌剂对棉花早期微生物群落多样性有影响。其中芽孢杆菌属丰度变化较大,芽孢杆菌属的数量随着棉花生育期的推进而增加,且在棉花苗期、蕾期和花铃期时芽孢杆菌的数量比对照组含量显著增加。本研究表明,施用B.axarquiensis TUBP1-315gfp可以改变棉花根际土壤的微生物群落结构。4.gfp基因标记的阿萨尔基亚芽孢杆菌对棉花黄萎病生防效果:棉花根部接种GFP标记的阿萨尔基亚芽孢杆菌后,棉花黄萎病发病率显著下降,尤其是在棉花花铃期和吐絮期,生防效果约为40%,与没有荧光标记的野生菌株生防效果(42.6%)相当,且棉花根部接种GFP标记的阿萨尔基亚芽孢杆菌浓度为10 ~8 CFU/mL(T2)和浓度为10 ~100 CFU/mL(T3)时生防效果相当。除此之外,对棉花产量和质量指标也有所提高,在浓度为10 ~8 CFU/mL(T2)时棉花产量能提高40.6%,其中纤维长度(FL),均匀度指数(UI),纤维强度(STR),短纤维指数(SHI)与对照组相比有明显提高。