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本研究以(木奈)(Prunus salicina Lindl.var.cordata J.Y.Zhang et al.)嫩叶为材料,应用染色体步移技术,克隆了(木奈)果肉PPO基因的启动子,应用PlantCare软件对启动子的核心元件和顺式作用元件进行分析;将启动子部分缺失序列载体构建、基因枪转化和GUS基因瞬间表达产物的组织化学染色技术相结合的方法,对(木奈)果肉和叶片PPO基因启动子的功能进行鉴定,为进一步采用启动子顺式作用元件的改造,有效降低PPO基因的表达,解决(木奈)果肉褐变问题开辟另一条新的遗传改良途径。主要试验结果如下:1.采用染色体步移技术,克隆了(木奈)果肉PPO基因的启动子本研究采用接头PCR和交错式热不对称PCR两种染色体步移技术,克隆(木奈)果肉PPO基因启动子,试验结果表明,交错式热不对称PCR优于接头PCR,扩增产物长,约700 bp左右,经测序,该产物长度为768 bp,涵盖接头PCR扩增产物(495 bp)的所有序列,经NCBI-BLAST分析,该序列与桃PPO基因启动子核苷酸序列的同源性为78%;用Plant CARE软件进行分析,结果表明,该序列在第585～635 bp处存在可能的基础启动子区域,转录起始点在第625 bp处的A,并发现了核心启动子的保守元件,如TATA-Box、CAAT-Box、G-Box等,还有一些重要顺式元件,如I-box、G-Box、GATA-motif、AT-richsequence、MBS等,这些元件可能与(木奈)果肉PPO基因启动子的组织特异性相关,因此,可以推断,本研究克隆到的(木奈)果肉PPO基因5′端调控序列具备植物启动子的基本特征。2.(木奈)果肉和叶片PPO基因启动子的功能鉴定采用启动子部分缺失序列载体构建、基因枪转化和GUS基因瞬间表达产物的组织化学染色相结合的方法,对(木奈)果肉和叶片PPO基因启动子的功能鉴定。将含不同长度(木奈)果肉PPO基因5′端调控序列缺失片段(569 bp、314 bp和215 bp)和(木奈)叶片PPO基因5′端调控序列缺失片段(1160 bp、1037 bp、935 bp和825 bp),正向取代植物表达载体pCAMBIA1301(含GUS基因)中的35S启动子,将这些质粒用基因枪转化(木奈)叶片和果肉,经组织化学染色观察GUS基因瞬间表达情况,试验结果表明,含569 bp启动子缺失片段的质粒在果肉中GUS基因的表达最强,100%的果肉都被染成深蓝色,含314 bp启动子缺失片段的质粒在果肉中GUS基因的表达强度较弱,只有不到5%的果肉被染上蓝色,而215 bp启动子缺失片段的质粒在果肉中GUS基因根本不表达,将上述3种质粒,用基因枪轰击的叶片组织,GUS基因根本不表达,叶肉组织不被染色,未见蓝色斑点,因此,可以推断,(木奈)果肉PPO基因启动子为果实特异性启动子,且该启动子基础区域的长度在324～569 bp;将含不同长度(木奈)叶片PPO基因启动子缺失片段(1160 bp、1037 bp、935 bp和825 bp)的质粒,用基因枪转化的(木奈)叶片和果实,结果表明,GUS基因在转化的(木奈)叶片和果实组织中都表达,能见到蓝色斑点,可以初步断定,(木奈)叶片PPO基因启动子在嫩叶和果肉组织中都起作用,为组成型启动子,该启动子的基础区域必须小于825 bp,至于基础启动子区域的准确长度有待于用缺失载体构建和基因枪转化进一步证实。