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自体骨髓间充质干细胞是一种来源广泛,取材简单、免疫原性低,具有多向分化潜能的成体干细胞。治疗急性肝衰竭具有极大的应用前景。在发现肝衰竭炎症内环境严重影响移植细胞活性及功能的基础上,选用临床广泛应用的乳糖酰基壳聚糖作为载体材料,构建具有肝靶向作用的白细胞介素1受体拮抗剂载药纳米缓释粒子。为了更好的示踪移植干细胞体内分布和转化等功能发挥,前期进行慢病毒介导绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),以获取GFP-MSCs细胞系。将载药纳米粒子通过外周静脉注入体内,利用其肝靶向性到达肝内；随后自体MSC通过门静脉移植至肝内,两者联合应用于猪急性肝衰竭的治疗。以期通过该载药粒子的局部药物靶向缓释,改善肝衰的炎症内环境,从而提高移植细胞的活性和功能,促进自体骨髓间充质干细胞在肝内的增殖与分化,促进肝再生,改善肝脏功能。第一部分骨髓间充质干细胞的体外培养、扩增、标记和鉴定目的：使用慢病毒介导GFP基因转染,以获取GFP-MSCs细胞系,示踪移植干细胞体内各种生物行为。方法：采用密度梯度离心法分离猪骨髓间充质干细胞,贴壁培养法不断传代纯化,并用慢病毒介导外源荧光蛋白基因转染MSCs,流式细胞仪检测转染后MSCs表面标志物和荧光表达强度,MTT法检测转染后MSCs增殖能力。结果：骨髓单个核细胞经过多次传代,间充质干细胞不断贴壁生长,形态比较均一,呈长梭形,类似成纤维细胞,而杂质细胞逐渐减少。将纯化的MSC细胞与MOI80带有嘌呤霉素抗性的慢病毒孵育,一段时间后,经嘌呤霉素筛选出荧光强度较强,并长期维持较高水平的GFP-MSC细胞系。流式细胞分析显示MOI80时,感染效率为80%,平均荧光强度为11076。流式细胞仪检测结果显示CD90+、CD44+的细胞占总细胞数的百分比90%(图2),CD45几乎不表达,表明外源基因转染的MSC细胞仍保持间充质干细胞特性,且纯度较高。MTT法显示GFP-MSC与普通MSC一周内的生长规律相似且两组细胞在各个时间点的吸光度值无明显差异。结论：熟练掌握密度梯度离心法分离、培养和纯化猪骨髓MSCs,且形态规则、增殖能力强,符合下一步实验要求：在此基础上通过慢病毒介导外源基因转染MSCs构建GFP-MSCs细胞系,且FCM显示转染后细胞仍保持间充质干细胞特性,且纯度较高,可作为报告基因稳定有效示踪MSCs的肝内分布。第二部分IL-1Ra纳米缓释颗粒的制备及功能验证目的：制备IL-Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒,为有效改善ALF炎症内环境提供理想有效的方法。方法：采用静电喷射法制备IL-Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒；采用FITC荧光标记的乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒分别与肝细胞和MSC孵育,荧光显微镜下观察其肝细胞靶向性,流式细胞仪检测两种细胞激发荧光的比例和强度；ELISA法检测IL-Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒外周静脉注射24h后心、肝、肾等组织中IL-Ra含量；ELISA法检测IL-Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒在PBS液中的释放规律。结果：红外谱图显示乳糖酸(LA)的羧基特征峰(1742.66cm-1)消失,壳聚糖(chitosan, CS)的氨基特征峰发生偏移；核磁共振图谱显乳糖酰基壳聚糖(GC)的特征峰(4.3ppm)为乳糖酸羧基与壳聚糖氨基反应生成的酰胺键上氢的的特征峰。扫描电镜显示制备出的IL-1Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒形貌良好,分布均匀。荧光显微镜下未见围绕分枝状MSC细胞的绿色荧光,而所有肝细胞均靶向有绿色荧光的纳米颗粒。流式细胞仪分析被靶向的肝细胞比例达到97.2%,荧光强度几何平均值较对照组高出近十倍。肝组织研磨液ELISA法检测IL-1Ra浓度平均值为147.15pg/ml,显著高于血清、肾脏和心脏组织,同时与血清成分相比有显著差异(P<0.05)。ELISA检测IL-1Ra缓释过程：1-3h突释峰,3-9h的平台期,9-30h快速释放峰,最后累计释放量趋于稳定。结果显示IL-1Ra纳米颗粒经过两次快速释放后IL-1Ra累计释放量在30%左右,还有大部分IL-1Ra控释在纳米颗粒中。结论：采用静电喷射法在接收距离为10cm,流速为0.7ml/h,电压为14kV的操作条件下,稳定喷射,成功制备出形貌较优,分布均匀,包封率较高的IL-1Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒。体外及体内实验进一步证实其具有显著的肝细胞靶向性及缓释功能。这为IL-1Ra应用于急性肝衰竭解提供了良好的思路。第三部分IL-1Ra纳米缓释颗粒联合MSCs移植治疗猪ALF的实验研究目的：探讨炎症因子拮抗剂与干细胞移植联合治疗肝功能衰竭的协同效应及其机理,为干细胞移植治疗肝功能衰竭提供更广阔的应用途径。方法：D-氨基半乳糖(D-Gal)诱导建立猪急性肝衰竭模型,34中华实验小型猪随机分为五组,造模对照组：门静脉移植生理盐水；IL-1Ra组：门静脉移植生理盐水前6h耳背大静脉推注IL-1Ra;单纯骨髓间充质干细胞移植组：门静脉移植8×107骨髓间充质干细胞；联合治疗组(包括IL-1Ra联合骨髓间充质干细胞移植组和IL-1Ra纳米颗粒联合骨髓间充质干细胞移植组)：耳背大静脉推注IL-1Ra或IL-1Ra纳米缓释颗粒,门静脉移植8×107异体骨髓MSCs。移植后4周内定期检测肝功能、炎症因子变化和病理改变并监测移植细胞体内存活、转化和分泌情况。结果：各组存活动物肝功能在2-3周基本恢复到正常水平,与其余各组比较,E组肝功能显著改善(P<0.05)。B超检测腹水显示纳米颗粒组一周时仅少量腹水,不易测量,单纯细胞移植组最大腹水距离为3.97cm,肝衰竭对照组最大腹水距离为5.35cm。ELISA检测各组血清炎症指标动态变化情况均为造模24h后迅速上升,短时间内到达高峰,持续数日后缓慢下降；与对照组比较,纳米颗粒组IL-1、TNF-α、和IL-6均显著改善(P<0.05)。Ki67阳性细胞在肝衰竭3天迅速上升,1周时达到高峰；A、B组增殖细胞数随后直线下降,第3周恢复正常增殖水平(21.2±2.5),E组虽有降低,但维持在较高水平(68.8±9.1)(P<0.05)。荧光显微镜及抗GFP免疫组化结果均可见2周末纳米颗粒组移植细胞数较单纯移植组明显增多,且前者肝小叶实质内可见散在分布的移植细胞。免疫荧光染色显示分布于肝脏的移植细胞(绿色荧光)并未同时显示红色荧光的CK18,相反,western blot检测C、D、E组肝组织HGF、VEGF的表达量明显高于对照组,且以纳米颗粒组最多。结论：IL-1Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒通过对宿主内环境的持续有效控制协同移植干细胞的多种分泌功能共同促进肝衰竭动物的恢复。