论文部分内容阅读
αB-晶状体蛋白在晶状体内含量最高,作为小分子热休克蛋白家族,具有分子伴侣活性功能,并能防止蛋白积聚,起到保护细胞的作用。α-晶状体蛋白是负调节蛋白,可以阻止和缓解应激细胞和视网膜感光细胞的凋亡,保护视神经。最近的研究显示,年龄相关性黄斑变性、青光眼视神经病变、视网膜缺血再灌注损伤、视网膜营养不良、糖尿病视网膜病变、视网膜撕裂和神经系统多发性硬化、Parkinson’s、Creutzfeldt-Jakob等病变都与αB-晶体蛋白有关。另外,研究显示,αB-晶状体蛋白还与阿尔茨海默症脑内纤维缠结有关系,但机制尚不清楚。因此,为了进一步研究其结构和生理功能,需得到纯度与活性较高的αB-晶状体蛋白。由于从生物提纯的α-晶状体蛋白中分离完整的αB-晶体蛋白具有一定的技术难度,而且α-晶体蛋白来源受限,产量较低,浓度和纯度差异大,限制其开发应用。随着蛋白质重组技术的发展和重组多肽类药物在临床中的应用,αB-晶体蛋白已经在大肠杆菌表达系统和哺乳动物细胞中得以表达,但得到的重组蛋白产量低,而且大肠杆菌表达系统表达的重组蛋白需经复性才能得到有活性的蛋白,代价昂贵。因此,我们通过毕赤酵母表达系统表达αB-晶状体蛋白,从而进行高通量生产,达到降低生产成本并提高产率的目的,也为αB-晶状体蛋白在后续基础研究以及临床试验研究中提供基础,后续我们还将通过改变其结构,以期得到更高活性的重组蛋白。本课题中,人工合成αB-晶状体蛋白的全长基因(CRYAB),并在基因序列的3’端引入了 His 6标签,之后将目的基因克隆到表达载体pPIC9K上,成功构建出CRYAB/pPIC9K重组质粒。然后,将构建的重组质粒通过电转的方法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,阳性菌株小量表达后经SDS-PAGE电泳检测,获得高表达的αB-晶状体蛋白毕赤酵母菌株。在此过程中,用单因素实验方法优化了毕赤酵母菌株表达过程中的四个因素:甲醇补加量、转接比、发酵时间和通气量,获得一个较优的发酵表达条件:补加甲醇量为每12小时补加至终浓度为0.5%,3:1的转接比,84小时表达时间。通过甲醇诱导表达获得重组αB-晶状体蛋白,经Western blot鉴定,确定其分子量约为43KD。经过Q Sepharose Fast Flow柱纯化,再经G-75 Sephadex凝胶过滤后,最终可从每升发酵液中获得30-40mg目的蛋白,并利用胰岛素还原法对重组a B-晶状体蛋白进行了分子伴侣活性测定,结果显示重组αB-晶状体蛋白能明显抑制还原剂DTT引起的胰岛素B链聚集沉积反应,说明重组αB-晶状体蛋白具有分子伴侣活性。