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溶藻弧菌是海水养殖鱼类的重要病原菌,其主要毒力因子为胞外碱性丝氨酸蛋白酶(Alkaline serine protease,Asp)。s RNA是一类广泛存在于细菌体内的非编码小RNA分子,通过碱基互补配对作用对靶标基因进行转录后调控,参与细菌不同生理进程。前期工作在溶藻弧菌体内鉴定得到5个可影响其碱性丝氨酸蛋白酶合成的s RNA分子,即Qrr1-5。为了阐明Qrr1-5调控碱性丝氨酸蛋白酶合成的分子机制,本文通过HPA显色反应检测了Qrr1-5对Asp活性的影响,进一步利用Western Blot、Realtime PCR、翻译融合、EMSA等手段深入研究了Qrr1-5对溶藻弧菌Asp表达调控的内在分子作用机制。主要结果如下:(1)通过HPA定量分析的方法对溶藻弧菌不同菌株中Asp活性进行研究,结果发现Qrr1-5对Asp的活性均具有一定的抑制作用,其中Qrr1、Qrr3的结果最为显著。采用Asp多克隆抗体对不同菌株中Asp蛋白的表达量进行检测,实验结果表现Qrr1-5抑制Asp的表达,且Qrr1、Qrr3的表现最为明显,这与HPA所得结果一致。利用Lux R抗体分别检测了?qrr1-5菌株、相应互补菌株以及野生型菌株中Lux R的表达情况,研究结果表明Qrr1-5对Lux R蛋白表达的调控均具有下调作用,且Qrr1、Qrr3最为明显,综合结果分析认为在高密度条件下Qrr1-5主要通过对Lux R的负调控作用影响Asp的表达。在Aph A-Flag/WT菌株的基础上成功构建了检测低密度关键调控元件Aph A的翻译融合菌株Aph A-Flag/?qrr1-5菌株,Aph A蛋白在低密度条件下表达,而在高密度条件下则不表达。Qrr1-5对Aph A蛋白表达的影响不尽相同,其中Qrr2和Qrr3对Aph A蛋白的表达具有一定的抑制作用,而其他的s RNA则对其表达影响不明显。(2)通过Realtime PCR研究了Qrr1-5与群体感应系统组成元件之间的相互作用。Qrr1-5对下游核心元件Lux R的m RNA水平影响不明显,对其蛋白表达有明显的抑制作用。而Qrr1-5对Aph A的m RNA水平影响也不明显,Qrr1和Qrr2对Aph A蛋白的表达水平有明显的抑制作用,Qrr3、Qrr4和Qrr5对Aph A蛋白表达水平无明显影响。此外,Qrr1-5对lux O、lux U基因的表达都具有一定的激活作用;而对溶藻弧菌三种信号分子合成酶表达情况的影响则不尽相同,Qrr1和Qrr3对Lux M、Lux S、Cqs A的表达均具有一定的激活作用,且对Cqs A的表达影响最为显著,其次为Lux M,而对Lux S影响最小。Qrr2和Qrr4对lux S、lux M、cqs A基因的表达影响较小;Qrr5对lux S以及lux M基因的表达影响不大,而对cqs A基因的表达有一定的正调控作用。同时,Lux R对qrr1-5这5个基因的转录均具有激活作用,且可与5种qrr基因启动子区均可以直接结合,且呈现浓度依赖性。而Aph A则可与qrr2、qrr3、qrr4基因启动子区结合,且呈现浓度依赖性,表现出较为明显的抑制作用。其中,Aph A与qrr4基因启动子区结合强度最高,与qrr3基因启动子区结合强度次之,且出现了两条滞后条带,即Aph A在qrr4基因和qrr3基因启动子区中可能存在两个结合位点;而在与qrr2基因启动子区结合时只出现一条带,表明其只有唯一的结合位点。而Aph A并不能直接与qrr1、qrr5基因的启动子作用。当群体感应元件lux O、lux U基因缺失之后,qrr1、qrr2、qrr3、qrr4、qrr5的转录水平较野生型均下调;其中,Lux O和Lux U对qrr2和qrr3基因的转录水平影响最为显著。而负责合成三种不同信号分子的合成酶对Qrr1-5编码基因转录水平的影响则不同。Lux R对Hfq的表达水平具有较为明显的抑制作用。而低密度调控元件Aph A对Hfq的表达情况则无明显的影响。而qrr1、qrr2、qrr3、qrr4、qrr5基因缺失之后,Hfq蛋白的表达水平较野生型菌株均有所提高,其中,Qrr5对其影响最为显著,而Qrr1影响较小。(3)通过生物信息学手段,利用Targe RNA2对Qrr1-5的靶标基因进行了预测分析。Qrr1-5在溶藻弧菌体内存在多种潜在靶标基因,分别负责不同生理功能相关蛋白的编码,如三型分泌系统相关的蛋白、热休克相关的蛋白、胞外多糖合成蛋白等。在生物信息学预测结果的基础上,对不同菌株胞外多糖进行了检测,其中Qrr1和Qrr3对胞外多糖的合成具有抑制作用,Qrr2、Qrr4、Qrr5则对胞外多糖的合成具有正调控作用,也证明了生物信息学预测识别靶标基因的可靠性。