背景与目的：卵巢癌是世界范围内最致命的妇科恶性疾病之一,由于缺乏典型的临床症状、特异的体征及肿瘤标志物等有效的筛查手段,绝大多数卵巢癌病人在得到诊断时已处于晚期,使其死亡率高居妇科恶性肿瘤首位。肿瘤的转移能力有赖于细胞的迁移与侵袭,然而决定肿瘤转移能力的分子机制目前仍然不十分清楚。因此,努力探索调控卵巢癌细胞转移潜能的分子靶标将至关重要。Hedgehog (Hh)信号通路在细胞命运决定以及细胞增殖过程中发挥重要作用。该通路由Hh配体,膜受体Ptch和跨膜信号转导蛋白Smo以及参与Hh信号转导的胞浆蛋白复合体组成,其级联传导的末点被公认为锌指转录因子Gli (Glioma-associated oncogene transcription factors),是该信号通路的关键节点,在信号转导中起枢纽作用。Hh靶基因涉及细胞增殖、细胞存活、细胞分化、细胞周期以及干细胞形成和细胞侵袭等多方面。有研究发现：卵巢癌中Hedgehog (Hh)信号通路异常活化,但信号通路异常活化与卵巢癌侵袭、转移的关系有待进一步明晰。本研究试图发现受Hh信号通路调控的靶基因,从临床标本、细胞及分子水平、动物模型等多个层次,采用细胞学、生物化学、分子生物学、生物信息学等多学科手段阐明受Hh信号通路调控的靶基因的作用及分子机制,进一步揭示Hh信号通路与卵巢癌侵袭与转移的关系,为卵巢癌诊疗策略的选择及抗癌新药研发提供理论依据。方法：第一部分人上皮性卵巢癌组织中Hedgehog信号通路异常活化与临床病理特征的关系(1)为了证实在卵巢癌中存在Hh信号通路的异常活化,我们采用免疫组化技术检测了65例卵巢癌病人卵巢肿瘤组织石蜡切片中Hh信号通路重要组分蛋白Gli2的表达情况,并且在此基础上将Gli2的表达情况与卵巢癌的临床病理特征进行了相关性分析。(2)同时,通过Western-blot及real-time PCR等方法检测卵巢癌及正常卵巢组织中Hh信号通路重要组分蛋白Shh、Gli1、Gli2等的蛋白水平及mRNA水平的表达情况。第二部分抑制Hedgehog信号通路降低卵巢癌细胞增殖与迁移能力(1)为了探索Hh信号通路与卵巢癌细胞增殖与迁移能力的关系,我们以卵巢癌细胞系(SKO-V3和ES-2)为研究对象,采用转录因子Gli特异性小分子抑制剂GANT61处理SKO-V3和ES-2细胞,对加药处理(实验组加30μM GANT61,对照组加等体积的DMSO)的SKO-V3和ES-2细胞通过Western-blot、 real-time PCR及免疫细胞化学方法在蛋白水平以及mRNA水平检测了Hh信号通路中相关组分,如跨膜受体Smo,终末转录因子Gli1和Gli2的表达情况。(2)加药处理(实验组加30μM GANT61,对照组加等体积的DMSO)后的SKO-V3和ES-2细胞,分别通过MTT比色法及BrdU增殖实验检测其细胞活力及增殖能力的变化。(3)加药处理(实验组加30μM GANT61,对照组加等体积的DMSO)后的ES-2细胞,通过细胞划痕实验及软琼脂克隆形成实验检测其细胞迁移及克隆形成能力的变化。第三部分抑制Hedgehog信号通路改变卵巢癌细胞基因表达谱(1)为了研究抑制Hh信号通路对卵巢癌细胞基因表达谱的影响,采用转录因子Gli特异性小分子抑制剂GANT61(实验组加30μM GANT61,对照组加等体积的DMSO),处理SKO-V3和ES-2细胞60hr,采用基因表达谱芯片技术分析其受Gli调控的差异表达基因,并对差异表达的基因进行GO (gene ontology) pathway分析和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes) pathway分析,发现受Hh信号通路调控的靶基因。并采用real-time PCR和Western blot分别对芯片发现的富集于某些信号通路的差异基因以及相关基因(如ITGB4、FAK、 CD24、MMP7等)在mRNA水平和蛋白水平进行验证,以确认芯片结果的可靠性。(2)用Gli特异性小分子抑制剂GANT61,转录因子Gli的siRNA(miR-Gli1)和含Hh配体的条件培养液(Shh-Med)分别抑制或激活Hh信号通路,采用real-time PCR、Western blot以及细胞迁移实验研究Hh信号通路调控卵巢癌细胞的侵袭与转移的分子机制。第四部分抑制Hedgehog信号通路减慢卵巢癌生长为了在体内水平研究Hh信号通路对卵巢癌生长的影响,我们采用卵巢癌组织块皮下移植法构建荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型；并利用此动物模型,给予GANT61(浓度10mg/ml,0.2m1/次)和同体积的溶剂对照处理,观测卵巢癌体积的变化,比较瘤体重量的改变；同时采用Western blot技术检测瘤组织中Gli1和Gli2的表达水平的变化,免疫组化技术检测瘤体中整合素integrinβ4(ITGB4)和磷酸化的粘着斑激酶(p-FAK)的表达情况。结果：第一部分人上皮性卵巢癌组织中Hedgehog信号通路异常活化与临床病理特征的关系(1)人卵巢癌组织标本行Western blot检测及real-time PCR检测,发现其Shh, Gli1和Gli2蛋白表达水平明显高于正常卵巢组织；Shh, Gli1和Gli2mRNA水平明显高于正常卵巢组织,差异有极显著统计学意义(p<0.01)提示：卵巢癌组织中Hh信号通路异常活化。(2)人卵巢癌组织标本免疫组织化学染色提示：Gli2的蛋白表达水平与卵巢癌患者的临床病理分期相关,其中晚期(Ⅲ-Ⅳ期)的卵巢癌患者的Gli2蛋白的高评分发生率明显高于早期(Ⅰ-Ⅱ期)的卵巢癌患者,差异有统计学意义(p<0.05)；与卵巢癌患者的年龄、病理组织学类型、分化程度及是否存在淋巴结转移无明显相关,差异无统计学意义(p>0.05)。第二部分抑制Hedgehog信号通路降低卵巢癌细胞增殖与迁移能力(1)Gli特异性小分子抑制剂GANT61降低ES-2和SKO-V3细胞的Gli1及Gli2蛋白表达水平；GANT61降低ES-2和SKO-V3细胞的Gli1和Gli2的mRNA表达水平,差异有极显著统计学意义(p<0.01)；经GANT61处理后细胞免疫荧光显示：Gli1蛋白表达水平显著降低。(2)Gli表达下调可直接抑制卵巢癌细胞活力,(MTT法；p<0.01)；降低其增殖活性,(BrdU法；p<0.01)。(3) GANT61抑制卵巢癌细胞(ES-2)的迁移能力,(划痕实验；p<0.05)；GANT61抑制卵巢癌细胞(ES-2)的克隆形成能力,(软琼脂法；p<0.01)。第三部分抑制Hedgehog信号通路改变卵巢癌细胞基因表达谱(1)基因芯片表达谱及通路网络分析结果显示：SKO-V3细胞经GANT61处理60hr后的差异表达基因的通路网络中,主要影响细胞粘附相关信号通路为主,既有部分表现为上调,同时也有部分表现为下调,其中以整合素蛋白integrins与骨架蛋白lamin为主。同时,MAPK信号通路也有明显的差异基因的富集,而该通路中差异表达基因绝大多数表现为上调,仅少数几个表现为下调。(2)采用real-time PCR和Western blot在mRNA以及蛋白水平验证芯片结果,发现经GANT61处理的SKO-V3细胞,ITGB4, COL1A1, COL5A1等基因mRNA水平表达明显下降,(p<0.01)；而LAMC2, ITGA5, LAMA3等基因mRNA水平表达明显升高,(p<0.01),与Microarray所获结果一致。此外,CD24,CD70, S100A2及MMP7等mRNA表达水平下降,(p<0.01);而S100A4和FAK mRNA水平无显著差异,(p>0.05),与Microarray所获结果基本一致；Western blot结果显示：GANT61处理的SKO-V3细胞,ITGB4, CD24, MMP7等蛋白表达水平明显下降,(p<0.01)；而FAK蛋白表达水平改变不明显,(p>0.05),与real-time PCR结果基本一致。(3)采用Shh配体条件培养液(Shh-Med)激活Hh信号通路,观察上述差异基因的表达变化,结果提示：Shh配体条件培养液(Shh-Med)处理SKO-V3细胞后,ITGB4的蛋白表达水平以及mRNA表达水平明显增加,(p<0.01)。此外,细胞侵袭实验提示：Shh-Med刺激Hh信号通路所引起的SKO-V3细胞侵袭能力的增加可以被抗ITGB4抗体(anti-ITGB4)所阻断(p<0.01)。(4)为了证实GANT61对转录因子Gli作用的特异性,我们采用Gli1特异的siRNA (miR-Gli1-720)干扰Glil的表达,Western blot结果显示：miR-Glil-720转染的SKO-V3细胞中Gli1及ITGB4的蛋白表达水平明显下降,与GANT61的抑制效果一致。(5)有文献报道ITGB4可调控FAK信号,为了阐明Hh信号通路影响ITGB4表达的生物学意义,我们采用Shh-Med和GANT61分别处理SKO-V3细胞,结果提示：Shh-Med处理SKO-V3细胞后,FAK的蛋白表达水平未明显改变,而磷酸化的FAK (p-FAK)水平明显增加,(p<0.01); GANT61处理SKO-V3细胞后,FAK的蛋白表达水平未见明显改变,而p-FAK水平明显下降,(p<0.01),另一方面,Western blot结果显示：Hh信号通路激活所引起的SKO-V3细胞p-FAK水平的增加可以被anti-ITGB4所阻断。提示Hh信号通路激活可通过ITGB4介导促进FAK蛋白磷酸化。(6)此外,我们采用免疫细胞化学方法观察抑制Hh信号通路对FAK磷酸化及细胞骨架的影响,结果显示：经GANT61处的SKO-V3细胞p-FAK-Y397的表达水平明显下降,提示：抑制Hh信号通路可影响FAK的活化；同时,经GANT61处理后,SKO-V3细胞骨架发生破坏,细胞伪足明显减少,提示：抑制Hh信号通路可影响SKO-V3细胞的侵袭能力。第四部分抑制Hedgehog信号通路减慢卵巢癌生长(1)为了在体内水平研究Hh信号通路对卵巢癌细胞生长的影响,我们成功采用瘤组织块皮下移植法构建荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。(2)实验组(GANT61组)比对照组(溶剂组)裸鼠肿瘤生长速度明显下降,尤其是在给药4次后,对照组肿瘤体积增长迅速,而实验组肿瘤体积缓慢增长。实验结束时将两组裸鼠皮下移植瘤离体后称重,实验组瘤体重量明显低于对照组,差异有极显著统计学意义(p<0.01)。(3) Western blot结果显示：实验组裸鼠皮下移植瘤中Gli1和Gli2蛋白表达水平明显低于对照组裸鼠,相对定量结果提示差异有极显著统计学意义,(p<0.01)；免疫组织化学法检测实验组裸鼠及对照组裸鼠皮下移植瘤中ITGB4及p-FAK的蛋白表达水平,结果显示实验组相比对照组瘤体中ITGB4及p-FAK的蛋白表达水平明显下降。结论：1、卵巢癌组织中Hh信号通路异常活化,Hh信号通路重要组分蛋白Gli2的表达水平与卵巢癌的临床病理分期密切相关。2、GANT61降低卵巢癌细胞(ES-2和SKO-V3)的Gli1和Gli2表达水平,同时,抑制ES-2和SKO-V3细胞的活力、增殖、迁移及克隆形成能力。3、采用Gli特异性小分子抑制剂GANT61处理SKO-V3细胞,通过基因芯片表达谱分析筛选出差异表达基因,并且选择部分与细胞粘附及迁移密切相关的基因进行蛋白水平及mRNA水平的鉴定,鉴定结果与芯片分析结果一致,转录调节因子Gli的下调降低ITGB4的表达,通过抗ITGB4抗体阻断ITGB4/FAK信号途径可以抑制Shh介导的卵巢癌细胞的迁移和侵袭,提示Hh信号通路很可能是通过ITGB4/FAK信号途径来调控卵巢癌的侵袭、转移。4、GANT61缩小荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型中肿瘤的体积及重量,且实验组移植瘤中Gli1、Gli2、ITGB4及p-FAK的蛋白表达水平均下降,提示：Hh信号通路的终末转录因子Gli有望成为卵巢癌诊疗策略的新靶点,为抗癌新药研发提供理论依据。