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柿（Diospyros kaki Thunb.）是医食两用的大宗水果,具有多重营养价值和保健功效,富含多酚、单宁、黄酮、色素、维生素、膳食纤维等天然活性成分,是极具潜力的优势植物资源。柿单宁作为柿果特有的天然化合物,是柿果生理活性的主要贡献者,对其生理生化特性的全面挖掘已然成为推动柿单宁开发应用和柿产业综合发展的首要任务。现有研究表明,柿单宁具有清除自由基、防止动脉粥样硬化、抗辐射等生理功能,其具体的作用机制已有初步研究。然而,目前对柿单宁抑菌活性的研究大都采用其粗提物,成分复杂,不利于分析验证,故其抑菌机制也难以明确。因此,为阐明柿单宁的抑菌活性及相关抑菌机理,本研究以筛选柿单宁优质提取原料和优化提取工艺为基础,提取并纯化得到高纯度柿单宁,进而以食源性（猪肉源）耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）为受试菌种,分析评价柿单宁的抑菌活性,并借助细胞生物学、转录组学和代谢组学技术,从细胞水平、转录水平和代谢水平综合解析柿单宁对MRSA菌体的影响,系统揭示柿单宁的抑菌机理,为柿资源综合利用及新型抑菌剂的研发奠定理论基础。主要结果如下:1.柿果生理活性物质变化规律及柿单宁提取原料筛选。以六个非商业种植的柿品种（金瓶柿、沙谷一号、火罐、禅寺丸、富有和阳丰）为研究对象,以果实生长发育的整个过程（开花后30～170 d）为监测周期,对柿果皮和果肉的单宁、色素含量及抗氧化能力的变化规律进行系统研究。结果表明,柿单宁含量受柿品种、生长周期和果实部位的综合影响。不同柿品种果肉中单宁含量由高到低为:涩柿＞不完全甜柿＞甜柿,而果皮中含量差异并不显著。随着果实生长发育,柿果肉和果皮中单宁含量均逐渐降低。柿果皮和果肉的抗氧化能力与柿单宁含量变化类似,二者间呈正相关关系。叶绿素含量主要受生长周期和果实部位的影响,一般在花后70 d左右达到峰值,果皮的叶绿素含量极显著高于果肉。单个柿果中单宁含量受柿品种和生长周期的影响。涩柿单果中单宁含量最高,约在花后110～130 d达到峰值。此外,柿果硬度在花后110 d之前维持稳定,110 d后迅速降低。综合柿单宁、色素、抗氧化性及果实硬度的变化规律,最终认为花后110 d的涩柿果肉最适宜作为柿单宁提取的原料。2.柿单宁提取工艺优化及比对分析。以优质涩柿果肉为提取原料,采用响应面法对超声波辅助提取法（Ultrasonic assisted extraction,UAE）和传统水浴提取法（Water bath extraction,WBE）提取柿单宁的工艺进行优化,并从提取效率、对提取原料及提取产物的影响三个方面对这两种提取方法进行综合比较分析。优化后的UAE提取工艺条件为:超声波功率207 W,提取时间30.9 min,液料比21.1:1 m L:g,提取温度55.0℃,柿单宁产率为33.96 mg/g。WBE的最佳提取条件为提取温度73.5℃,提取时间63.0 min,液料比32.4:1 m L:g,柿单宁产率为32.39 mg/g。经比对分析,UAE的柿单宁提取产率比WBE提高了4.94%,但提取温度为WBE的75.34%,液料比为65.12%,提取时间为49.05%。相比WBE,UAE显著改变了提取原料的结构,但并未对柿单宁的光谱吸收特性及抗氧化能力产生不利影响。综上所述,UAE在柿单宁提取中具有产率高、能耗低、产物性质稳定等优点。另外,柿单宁粗提物经大孔树脂纯化后,纯度可达92.88%。3.柿单宁对MRSA抑菌活性的测定及抑菌机理初探。采用琼脂稀释法检测发现,柿单宁对4株猪肉源MRSA均表现出抑菌活性,最小抑菌浓度为1000μg/m L。利用液体稀释法绘制MRSA的生长曲线并进行拟合表征,结果表明柿单宁可显著抑制MRSA增殖,延长菌体迟滞期,降低菌体最大生长速率。系列生化检验结果表明,柿单宁处理可显著降低菌体膜电势和胞内ATP含量,破坏菌体细胞膜及蛋白完整性,影响菌体细胞周期,造成S期阻滞。同时,菌体的表面疏水性和溶血活力也显著降低。另外,电镜观察显示,柿单宁可显著改变菌体的正常生理形态,导致菌体出现变形、凹陷、破损、内容物溢出等不可逆损伤。初步推测柿单宁通过改变MRSA菌体细胞膜通透性及细胞功能来发挥抑菌作用。4.柿单宁抑菌机理的转录组学分析。基于Illumina Hi Seq PE150测序平台对柿单宁（500μg/m L）处理下MRSA菌体转录水平的变化进行表征,经数据质控、参考基因组比对和基因表达量分析,共获得370个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,其中200个上调,170个下调。Gene Ontology（GO）结果显示,DEGs主要涉及催化活性、绑定、细胞膜、细胞、代谢过程和胞内过程等。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）注释结果表明,DEGs主要参与细胞膜转运、氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢等代谢路径。Clue GO+Clue Pedia分析发现,参与ABC转运、氨基酸代谢、嘧啶代谢等路径中的DEGs大多上调,而参与氮代谢、糖酵解、TCA循环等代谢路径的DEGs大多下调。深入分析发现,柿单宁可破坏细胞膜的生理功能,导致膜通透性升高,p H调节功能受损,进而导致氨基酸代谢紊乱,能量代谢受到显著抑制。同时,柿单宁处理造成菌体营养物质摄取相关基因表达量大幅下调,导致胞内氨基酸匮乏,加剧代谢紊乱,进而抑制菌体生长。这些结果表明膜损伤和营养物质限制是柿单宁抑菌的主要作用机制。5.代谢组学研究及反向验证。采用代谢组学技术对柿单宁（500μg/m L）处理下MRSA菌体代谢产物的种类和变化进行检测,经主成分分析和偏最小二乘法判别分析发现,处理组与对照组菌体的代谢谱具有显著差异。总共筛选得到19种差异代谢产物（Differential metabolites,DMs）,其中12种上调,7种下调。KEGG结果表明,DMs主要是与氨基酸代谢、TCA循环和氮代谢等相关的代谢产物。深入分析发现,柿单宁对菌体的氨基酸和能量代谢均产生显著影响。柿单宁处理组菌体内天冬氨酸、赖氨酸、酪氨酸和鸟氨酸的消耗加剧,脯氨酸等具有调节菌体渗透压、清除自由基功能的物质大量积累;尿素等碱性物质含量升高;琥珀酸和柠檬酸含量升高,TCA循环阻滞。可见,代谢物的变化及流向大多与细胞膜损伤、营养物质匮乏及能量代谢阻滞密切相关,进一步证明转录组的结果。