论文部分内容阅读
板栗为壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea Miller）植物,在我国南北皆有分布,是我国的特色果树。板栗是原产我国的重要干果之一,种质资源非常丰富。但由于长期实生繁殖,品种命名标准不一,造成品种资源底码不清,同名异物或同物异名现象严重,给板栗资源研究、保存、评价、利用及新种质的创新等带来很大困难。尽管前人利用分子标记对板栗也进行了一些研究,但利用AFLP技术对板栗进行研究的报道寥寥无几。AFLP（扩增片断长度多态性）是一种新的DNA分子标记技术,具有丰富的多态性、较好的稳定性和较高的个体特异性,广泛应用于品种鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位等方面。本试验在建立较稳定的板栗AFLP银染技术体系基础上,筛选出22对谱带清晰、多态性好的引物组合,构建了47份板栗材料的指纹图谱,分析了其遗传多样性,以期为板栗品种鉴定、亲缘关系分析、高密度遗传图谱构建、核心种质构建等奠定基础。 主要研究结果如下: 1.针对板栗叶片组织中酚类物质、多糖、蛋白质等含量较高的特点,采用改良的CTAB法,并添加不同的抗酚类氧化褐变物质,筛选出适宜AFLP分析的板栗基因组DNA最有效的提取方法。结果表明:DNA提取液中加入2%CTAB,3%PVP-40,1%β-巯基乙醇,20mmol/L Na2S2O5等物质,所提取板栗DNA纯度高、基本无降解,适于AFLP分析要求。 2.通过对板栗AFLP银染技术体系进行系统研究,建立了适于板栗AFLP分析的最佳体系。酶切体系总体积20μL中含纯化DNA300ng、EcoRI和MseI各3U、MseI Buffer 1μL,37℃酶切5h,然后65℃变性10min,以去除内切酶活性。变性后的酶切产物加入5μL连接液,并在PCR仪上37℃保温12h。其中连接液包括:MseI adapter(50pmol·μL-1)1.0μL,EcoRI adapter(5pmol·μL-1)1.0μL,ATP(10mmol·L-1)1.6μL,T4DNAligase(3U·μL-1)0.7μL,T4Buffer 0.5μL,ddH2O 0.2μL。连接完成后,将连接产物置于设定在65℃下PCR内变性10min,以去除连接酶的活性。之后,连接产物稀释10倍进行预扩增。预扩产物稀释10倍进行选扩。选扩完成后,加入10μL Loading buffer,95℃变性10min,变性后立即冷却,置于-20℃保存备用。取8μL变性的选扩产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。电泳完成后,进行银染程序:固定、冲洗、染色、冲洗、显影、固定、冲洗、室温干燥等。 3.用8个DNA样品分别对64对引物组合（各含3个选择性碱基的8个EcoRI引物分别与各含3个选择性碱基的8个MseI引物进行组合）进行选择性扩增,从中筛选出多态性较好、电泳谱带较为清晰的22对引物组合对47份材料进行AFLP分析。