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研究背景:据流行病学统计,鼻咽癌在广西壮族自治区的发病率居全球第1位,而且明显高于全国平均水平。在广西,每年有2000多人死于鼻咽癌,其调整死亡率为4.63/10万,占全部恶性肿瘤死亡率的11.63%,在所有恶性肿瘤死亡人数中居第3位。由于鼻咽癌的解剖局限性和较高的放射敏感性,放疗治疗是鼻咽癌的主要治疗方法。尽管目前放疗设备日益更新,放疗技术随着科技不断进步,但是局部晚期鼻咽癌的预后仍较差,5年生存率小于60%。癌细胞对放射线抗拒是治疗失败的重要原因之一,因此,增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感性是提高鼻咽癌放射治疗效果的关键。CRISPR是细菌用于抵抗外来遗传物质入侵的一种获得性免疫机制,具有设计简单、特异性强、效率高,以及可在目标位点产生多种类型的编辑结果等优势。近年来CRISPR-Cas9技术大放异彩,通过设计sgRNA混合文库,CRISPR切割的靶点可以将全基因组覆盖,而且特异性高,既可通过诱导基因突变进行功能缺失型筛选,又可通过激活转录进行功能获得型筛选,并且于DNA水平抑制基因表达,可以研究那些需要基因敲除才能显现的表型,与RNAi技术相比具有相对较低的脱靶效率和更广泛的作用位点,因而逐渐成为功能性基因筛选的热点方法。目前尚无关于利用CRISPR/Cas9文库筛选鼻咽癌放射敏感及放射抵抗性功能基因的研究报道。研究目的:本研究首次利用全基因组CRISPR/Cas9-sgRNA文库病毒筛选鼻咽癌放射敏感及放射抵抗性功能基因,为进一步研究鼻咽癌放射敏感性的机制奠定基础,为发现新的治疗靶点和开发提高鼻咽癌细胞放射治疗敏感药物提供依据。研究方法:1.对鼻咽癌细胞放射处理后,应用CRISPR/Cas9文库慢病毒进行筛选,对放射敏感性有调控作用的基因所对应的sgRNA会被选择性富集或丢失,结合二代测序技术识别特异性sgRNA,筛选出放射敏感性及放射抵抗性候选功能基因。2.对单个候选基因分别敲除后利用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR进行验证,并对稳定低表达候选基因的细胞株进行放射处理,通过克隆形成实验、细胞增殖实验验证筛选的功能基因在鼻咽癌细胞中的放射敏感及放射抵抗性作用。3.建立鼻咽癌放射抵抗细胞株C666-1-Rs和5-8F-Rs,利用实时荧光定量PCR分析候选基因的差异表达水平,进一步验证其在鼻咽癌细胞中的放射增敏及放射抵抗作用。4.对目标基因进行GO及KEGG分析,预测与鼻咽癌放疗抵抗性相关的信号通路,为后续研究提供指导和帮助。研究结果:1.利用CRISPR/Cas9文库慢病毒筛选出210个放射敏感性及放射抵抗性功能基因,结合生物信息学分析筛选鉴定出11个鼻咽癌放射敏感性及放射抵抗性功能基因（放射敏感性基因:FBLN5、FAM3C、MUS81、DNAJC17、CALD1;放射抵抗性基因:TOMM20、CDKN2AIP、SNX22、SP1、PSIP1、TLNI）。2.与对照组相比,FBLN5、FAM3C、MUS81、DNAJC17单基因敲除后,鼻咽癌细胞C666-1和CNE1经放射处理后克隆形成和增值能力显著增强,而CDKN2AIP、SP1、CALD1单基因敲除后,C666-1和CNE1细胞经放射处理后的克隆形成和增值能力显著下降（p＜0.05）。3.在放射抵抗细胞株C666-1-R和5-8F-R中,FBLN5、FAM3C、MUS81、DNAJC17基因表达水平显著降低（p＜0.05）,而TOMM20、CDKN2AIP、SNX22、SP1基因表达水平显著升高（p＜0.05）。4.KEGG富集分析表明,潜在的信号通路有助于NPC的放射敏感性或放射抵抗性,包括范可尼贫血信号通路和TGF-beta信号通路。研究结论:通过CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除技术,筛选鉴定出9个与鼻咽癌细胞放射敏感性或放射抗性相关的基因:4个鼻咽癌放疗敏感功能基因:FBLN5、FAM3C、MUS81、DNAJC17;2个鼻咽癌放疗抵抗基因:CDKN2AIP、SP1;而TOMM20和SNX22是潜在的放疗抵抗基因,CALD1是潜在的放疗敏感基因。MUS81的鼻咽癌的放射抵抗性可能与范可尼贫血信号通路有关,SP1的鼻咽癌放射敏感性可能与TGF-beta信号通路有关。。