论文部分内容阅读
RNase1是动物胰脏分泌的一种重要的消化酶,是胰核糖核酸酶家族的重要成员。因在叶猴中发现其多拷贝与叶食性密切相关,而成为食性研究的热点基因之一。鲤科鱼类是我国重要的经济鱼类,食性广泛。本研究选取鲤(Cyprinus carpio)、黄尾鲴(Xenocypris davidi)、鳙(Aristichthys nobilis)、鲢(Hypophthalmichthys molitriac)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)、鳡(Elopichthys bambusa)、翘嘴鲌(Cluter alburnus)8种鲤科鱼类为实验对象,采用染色体步移(Genome walking)的方法克隆了8种鱼RNase1基因的蛋白编码区(CDS区)全长,分析了这8种鱼不同组织RNase1基因的表达差异,分析了鲤、团头鲂、鳙和翘嘴鲌不同组织RNase1蛋白的表达差异,获得如下结果:(1)8种鲤科鱼类RNase1基因的克隆和理化性质分析。鲤RNase1基因序列总长度为940 bp,其中CDS序列长度447 bp,编码149个氨基酸,预测分子量为17.49KDa,理论等电点(PI)为9.10;黄尾鲴RNase1基因序列总长度为1401 bp,其中CDS序列长度456 bp,编码152个氨基酸,预测分子量为17.49 KDa,PI为9.10;鳙RNase1基因序列总长度为2014 bp,其中CDS序列长度456 bp,编码152个氨基酸,预测分子量为17.33 KDa,PI为8.53;鲢RNase1基因序列总长度为2756 bp,其中CDS序列长度456 bp,编码152个氨基酸,预测分子量为17.26 KDa,PI为8.78;草鱼RNase1基因序列总长度为1033 bp,其中CDS序列长度456 bp,编码152个氨基酸,预测分子量为16.80 KDa,PI为9.05;团头鲂RNase1基因序列总长度为856 bp,其中CDS序列长度456 bp,编码152个氨基酸,预测分子量为17.32 KDa,PI为9.11;鳡RNase1基因序列总长度为1439 bp,其中CDS序列长度456 bp,编码152个氨基酸,预测分子量为17.40 KDa,PI为9.11;翘嘴鲌RNase1基因序列总长度为1643 bp,其中CDS序列长度456 bp,编码152个氨基酸,预测分子量为17.26 KDa,PI为8.94。BLAST分析显示8种鲤科鱼类间的RNase1基因编码的氨基酸序列相似度较高(65.7%~99.2%),均具有24个氦基酸左右的信号肽序列,保守的“CKXXNTF”功能区,3个催化碱基(1个赖氨酸和2个组氨酸)形成催化三联体,同时包括6个半胱氨酸形成3个二硫键。氨基酸进化树显示团头鲂与翘嘴鲌关系最为接近,鳡与黄尾鲴接近,鲢鳙接近,它们都与青鳉差异最大。(2)荧光定量实验采用β-actin为内参基因,结果显示:肌肉组织中RNase1基因在鳙的表达量最高,团头鲂最低,鲢和鳙高于其它鱼类;性腺、心脏、肝、脾、肾中,鲢和鳙RNase1基因的表达量与其它鱼类差异显著(P<0.05);鳃、脑、肠道中,鳙RNase1基因表达量较高,与其它鱼类差异显著;血液中,翘嘴鲌RNase1基因表达量较高,与其它鱼类差异显著;除鳡以外其它鲤科鱼类均呈现肠RNase1基因表达量最高,与其它组织表达差异显著(P<0.05),肝、肾的RNase1基因表达量也相对其它组织较高。其中鲢和鳙血液中的RNase1基因表达量也相对较高。(3)为了研究不同组织RNase蛋白表达模式,本实验制备了团头鲂RNase1蛋白的多克隆抗体,选取4种典型食性的鱼作为RNase1蛋白表达研究对象。蛋白质免疫印迹(Western blot)结果显示:鲤、鳙、团头鲂、翘嘴鲌蛋白表达均呈现在肠和肝中表达,而其他组织未见表达。鲤、团头鲂和翘嘴鲌肠道的RNase1蛋白的表达水平高于肝脏,而鳙肝脏中RNase1蛋白的表达水平高于肠道。