甜乳清是牛奶加凝乳酶沉淀酪蛋白之后的上清液,在乳制品行业中是副产物,其中主要含有乳清蛋白和乳糖等生物活性物质,尤其是乳铁蛋白和免疫球蛋白G (IgG),具有较高的附加值。以较廉价的甜乳清为原料,生产乳铁蛋白、IgG、乳清蛋白和乳糖,一直受到学术界和生产企业的关注。扩张床吸附是一种新型的生物分离技术,集固液分离、澄清、浓缩和初步纯化于一体,可直接从含有颗粒的料液中捕获目标产物。原料分析：对六种不同来源甜乳清粉原料的蛋白质含量和各乳清蛋白含量进行测定,从中选取高附加值蛋白含量较高的作为后续实验的分离原料。对选定原料中各乳清蛋白的等电点、分子量等特性进行分析：乳铁蛋白的等电点显著高于其他乳清蛋白,可直接用阳离子交换提取；IgG的等电点次之,而且分子表面有疏水基团,可采用阳离子交换与疏水作用同时兼具的混合模式分离；剩余的乳清蛋白可一并制备成浓缩乳清蛋白粉；之后的剩余溶液再用来生产乳糖。依据该分离思路,研究了多种分离方法和相关分离机理,为确定整套甜乳清分离流程提供了依据。分离乳铁蛋白：详细考察了三种阳离子交换扩张床介质的基本理化性质、柱床特性以及包括静态吸附、吸附动力学和动态吸附等吸附特性,发现Fastline SP介质更适宜高流速操作,其柱床稳定,对乳铁蛋白的吸附量大,吸附速率快,确定其为后续分离介质。在静态吸附实验中发现,随着pH和盐浓度的升高,介质的吸附容量下降,通过分子模拟技术,比较了乳铁蛋白分子表面电势在不同条件时的变化,推测pH影响吸附的机理在于改变了蛋白表面氨基酸残基的质子化状态和分子表面电势分布,而盐浓度主要是静电屏蔽降低蛋白质表面电势,对电荷分布没有明显影响。通过计算蛋白和配基之间的结合能,量化了不同条件下的吸附能力,表征了pH和盐浓度的影响。针对Fastline SP介质,进行了优化实验,确定了分离条件为：1 L 50g/L甜乳清调节pH至7.5上样,扩张床的扩张率为2.0,洗脱条件为含0.5M NaCl的磷酸盐缓冲液(pH7.0),清洗用0.5M NaOH。经此一步扩张床分离,可得到纯度为88.5%的乳铁蛋白,纯化因子达到553,回收率为77.1%。分离免疫球蛋白G：采用混合模式的扩张床吸附剂纯化IgG,分离介质为阳离子交换和疏水作用兼具的混合模式介质Streamline direct CST-1 (CST-1),研究了CST-1介质的基本理化性能、柱床性能和吸附性能等,结果表明,该介质的柱床稳定,最适床层扩张率为2.0。用分子模拟研究了pH和盐浓度对IgG吸附的影响,发现pH升高会引起蛋白表面负电荷急剧增加而正电荷急剧减少,不利于吸附的进行；盐浓度增大,蛋白表面电荷分布基本不变,只是静电势变低,也在一定程度上减弱吸附。该理论研究的结论与吸附实验数据一致,均表明适宜吸附IgG的pH为6.0或7.0,盐浓度为0 M；洗脱可通过增加pH和盐浓度实现。最后优化并确定了洗脱缓冲液为含0.5 M NaCl的碳酸盐缓冲液(pH10.0),洗脱组分中IgG纯度为91.8%,回收率可达86.1%。过程集成化：设计了以扩张床层析方法为主的集成化分离路线,提出了三种组合策略：策略一,先用扩张床分离乳铁蛋白作为第一个分离步骤,分离后的穿透液,不经任何处理,直接进入第二根扩张床层析柱,进一步分离IgG；策略二,与策略一相同的是仍把分离乳铁蛋白作为第一个分离步骤,但不同的是,对其穿透液进行pH调节(至pH6.0),再上样与第二根层析柱分离IgG；策略三,在策略一的基础上,增加第二根层析柱中介质的装填量。考察了不同的组合方式产生的结果。由于第一根柱子的操作条件不变,三种组合模式的乳铁蛋白的分离效果均相同,但IgG的分离效果完全不同。在三种策略中,其纯度分别为91.9%、83.8%和92.4%；对应的纯化因子分别为196、179和197；回收率分别为14.3%、63.7%和29.7%。综合比较分离效果和工艺的可行性,确定按照策略二进行扩张床分离过程集成化。两根扩张床层析柱串联集成化,无需添置储存设备,可减少溶液用量,降低投入成本,而且减少操作时间,提高生产效率。制备浓缩乳清蛋白和乳糖：甜乳清经集成化分离乳铁蛋白和IgG后,其穿透液中还含有其他乳清蛋白和乳糖。通过优化超滤工艺,将穿透液进行超滤,利用10kDa超滤膜,在600 mL/min膜面流速和0.24 MPa跨膜压力条件下浓缩至特定程度,补加适量的纯水,即可完全分离乳清蛋白和乳糖。超滤产生的浓缩液直接干燥即为浓缩乳清蛋白(WPC),而透过液经浓缩、酒精沉淀、干燥即可得到纯度高达98.95%的乳糖粉。本文制备的WPC70和WPC 80,各项指标均达到相关标准的规定。综上所述,通过合理设计工艺流程和操作参数,集成化扩张床技术能够成功制备乳铁蛋白和免疫球蛋白,其穿透液还可以被进一步利用,生产浓缩乳清蛋白和乳糖。整个工艺简单,易于操作,可用于工业化生产。