目的:建立兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离培养的方法,并进一步研究其在旋转壁式生物反应器(rotating wall vessel bioreactor,RWV)内结合微载体培养技术实现大规模培养的条件。 方法:取3-14周龄的新西兰大白兔,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法这两种方法在培养瓶中培养兔骨髓间充质干细胞,并观察细胞形态特征、绘制生长曲线、流式细胞仪检测细胞表面分子及向成骨细胞诱导;利用微载体培养法在旋转壁式生物反应器内大规模扩增兔骨髓间充质干细胞,检测其组织形态及生物功能,并与静态培养作比较。 结果:对于4-7周龄的新西兰大白兔,采用密度梯度离心法分离得到的骨髓间充质干细胞在4-7代时细胞形态好,增殖能力强,适合作进一步研究用。细胞接种密度为1×10~5cells/ml、Cytodex-3微载体浓度为10mg/ml时,兔骨髓间充质干细胞在旋转壁式生物反应器中培养5天,细胞数达到最大,可扩增近10倍,而应用微载体技术在静态培养时只能扩增近4倍。同时对静态和动态培养的细胞进行形态、pH值、渗透压、葡萄糖、乳酸、流式检测及向成骨细胞诱导,发现旋转壁式生物反应器中培养兔骨髓间充质干细胞时,培养基的pH值在7.4-7.6之间,渗透压变化不大,与细胞在培养瓶中培养比较可见葡萄糖含量低而乳酸含量高。 结论:采用密度梯度离心法成功建立了兔骨髓间充质干细胞体外分离培养体系,而新型旋转壁式生物反应器可以为骨髓间充质干细胞的体外大规模扩增提供理想的三维培养体系。