[研究背景和目的]原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见的实体恶性肿瘤之一,严重影响人类的健康,在我国每年肝癌的发病率为20.37/10万,其死亡率高居癌症死亡率的第二位。目前,手术切除和肝移植仍是目前最有效的治疗手段,但疗效不佳,术后复发和转移是其最主要原因。HCC是个血供丰富的恶性肿瘤,血管生成被认为与HCC的侵袭转移密切相关。因此进一步探讨肿瘤血管生成在HCC侵袭转移中的分子机制有重要的理论意义和潜在的临床实用价值。血管内皮细胞生长因子(vasculaur endothelial growth factor, VEGF)是肿瘤血管生成中最主要的刺激因子,与HCC的侵袭转移和血管生成密切相关,被认为是HCC血管生成中最主要的刺激因子。Vasohibin-1是迄今为止发现的一个可以被VEGF或成纤维细胞生长因子2(FGF-2)诱导的血管生成负反馈抑制因子,因研究发现vasohibin-1参与肿瘤、视网膜疾病等血管新生异常疾病的发生、发展备受关注。目前已有研究发现vasohibin-1在乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌等有高表达,且与肿瘤的发生、发展密切相关。但在肝癌中尚未有相关研究。基于以上研究背景,本课题主要分析肝癌组织、肝癌细胞株中vasohibin-1基因/蛋白的表达水平；构建靶向人vasohibin-1特异性RNA干扰慢病毒表达载体,体外转染人高表达vasohibin-1肝癌细胞株,沉默肝癌细胞中vasohibin-1基因的表达,研究vasohibin-1基因被抑制后VEGF-A、MMP-9基因/蛋白水平的变化,以及对细胞周期、凋亡和增殖的影响,分析vasohibin-1作为新候选基因在调节肝癌血管生成中作用,初步探讨vasohibin-1参与调节肝癌血管生成的可能分子机制以及慢病毒介导RNAi沉默vasohibin-1基因在肝癌基因治疗中的应用前景,以开辟治疗肝癌的新途径。[方法]1. Vasohibin-1蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义：选取山东省立医院病理科存档且临床病理资料完整的117例肝癌组织及相应癌旁组织,应用免疫组织化学方法检测vasohibin-1、VEGF-A及肿瘤微血管密度(MVD,CD34标记)的表达,分析vasohibin-1、VEGF-A和CD34的表达相关性以及和肝癌患者临床病理特征的关系；采用Kaplan-Meier法回顾性分析vasohibin-1蛋白表达与肝癌患者生存期的关系；应用COX回归模型分析单因素和多因素危险系数,寻找提高肝癌预后评价敏感性和特异性的相关指标。2. Vasohibin-1基因／蛋白在不同肝癌细胞株和人正常肝细胞中的表达：采用免疫细胞化学、荧光定量PCR (Real time PCR)及Western blot技术检测不同侵袭、转移潜能肝癌细胞株中HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和MHCC-97L及人正常肝细胞株L-02中vasohibin-1的表达情况,筛选出高表达vasohibin-1肝癌细胞株。3.慢病毒介导的肝癌细胞vasohibin-1基因沉默：构建U6启动子驱动、带有绿色荧光蛋白(GFP)标志的、表达针对vasohibin-1基因的慢病毒RNAi载体,转染vasohibin-1高表达肝癌细胞,同时以转染阴性载体的肝癌细胞作为对照。荧光显微镜观察GFP表达以确定转染效率,通过Real time PCR、westem-blot分别检测细胞转染后vasohibin-1基因和蛋白的表达情况,明确RNAi的抑制效率,筛选出vasohibin-1沉默效率最高的干扰片段。4. Vasohibin-1沉默对肝癌细胞生物学行为的影响：将筛选出的最佳慢病毒pGCSIL-vasohibin-1RNAi载体转染肝癌细胞,沉默vasohibin-1的基因表达,通过四畔盐比色法(MTT)检测vasohibin-1干扰后对hepG2细胞增殖能力的变化；通过细胞划痕实验检测vasohibin-1沉默后hepG2细胞迁移能力变化；应用流式细胞技术检测vasohibin-1沉默对hepG2细胞周期和凋亡的影响。Real timePCR和western blot方法检测hepG2细胞转染pGCSIL-vasohibin-1RNAi后VEGF-A和MMP-9的表达变化,探讨vasohibin-1参与调节肝癌血管生成的可能分子机制。[结果]1. Vasohibin-1蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义：免疫组化检测结果显示vasohibin-1蛋白在117例肝癌组织中的总阳性表达率为38.5%,明显高于正常组织中阳性表达16.2%。且与肝癌组织表达的VEGF-A、CD34以及肝癌血管侵袭特征密切相关(P=0.014,0.035,和0.002)。随访发现,vasohibin-1高表达患者5年复发率高,生存率明显低于vasohibin-1(?)i氏表达患者。将vasohibin-1表达,临床病理特点等参数与肝癌患者复发和生存时间进行单因素和多因素分析,结果显示vasohibin-1, VEGF-A和肿瘤TNM是影响肝癌复发和生存预后的独立因素(P=0.002、0.006、0.022)。2. Vasohibin-1基因/1蛋白在肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达情况：Real timePCR和western-blot检测证实肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和MHCC-97L中vasohibin-1基因和蛋白水平明显高于人正常肝细胞株L-02,而且以hepG2中vasohibin-1表达含量最高,统计学分析差异具有统计学意义。细胞免疫组织化学证明vasohibin-1表达在hepG2细胞胞浆。3、慢病毒介导的肝癌细胞vasohibin-1基因沉默：以vasohibin-1mRNA基因序列为靶目标进行干扰片段设计,成功构建了四对针对vasohibin-1基因不同位点的特异性RNA干扰序列,经化学修饰后与pGCSIL-GFP慢病毒载体连接,通过转化,挑选阳性克隆进行测序,鉴定干扰片断的碱基序列及插入位点完全正确；在293T细胞中包装慢病毒,获得高滴度慢病毒上清；利用重组慢病毒载体将vasohibin-1RNAi转导入肝癌细胞hepG2中,荧光显微镜测定转染效率可达到80%以上,Real time PCR结果显示：pGCSIL-vasohibin-1RNAi-1,2,3,4组中vasohibin-1mRNA相对表达量分别为空白对照组的33.1%,56.5%,48.3%和81.6%；Western blot结果显示,pGCSIL-vasohibin-1RNAi-1,2,3,4组vasohibin-1蛋白相对表达水平与空白对照组相比下降,其中,又以vasohibin-1RNAi靶点1效果最好(P<0.05)。综合Real time PCR和、Nestern blot结果,4组干扰片段中,vasohibin-1RNAi靶点1的干扰效果最高。因此,选用vasohibin-1RNAi靶点1干扰片段进行后续实验。4、Vasohibin-1沉默对肝癌细胞生物学行为的影响：MTT法观察vasohibin-1基因表达沉默后体外细胞的增殖情况,与未转染细胞相比,细胞的增殖速度明显减慢,与呈时间依赖关系,差异有统计学意义(P<0.05),提示下调vasohibin-1基因表达抑制hepG2细胞增殖,使其生长速度减缓；细胞划痕实验发现vasohibin-1RNAi转染后对hepG2细胞的运动干扰影响不明显(P>0.05)；流式细胞术检测vasohibin-1基因表达沉默后体外细胞的周期和凋亡情况,与未转染细胞相比,细胞周期中S期的比例明显减少,G2/M期明显增多,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05),提示抑制vasohibin-1基因表达影响hepG2细胞周期的进程,使细胞周期阻滞于G2/M期,而且细胞凋亡细胞增多；Real time PCR和western-blot显示利用RNAi技术沉默vasohibin-1基因表达,与未转染细胞相比,vasohibin-1基因下调后对MMP-9的基因／蛋白表达水平没有影响,却可以在基因／蛋白质水平下调VEGF-A的表达,差别有统计学意义(P<0.05)。[结论]1. Vasohibin-1蛋白在肝癌组织中高表达,在癌旁组织中弱表达,且与肝癌的血管侵袭、VEGF-A, CD34表达有相关性,而且与患者预后有关,表明vasohibin-1可能是导致肿瘤发生发展的重要分子,vasohibin-1可作为临床检测的有重要参考价值的标志物,对判断肝癌预后有重要意义；2.RNAi慢病毒转染细胞hepG2后,vasohibin-1在mRNA及蛋白水平被显著、持久沉默；Vasohibin-1基因的沉默影响hepG2的细胞周期,发生G2/M期阻滞,进而抑制了细胞的增殖,使细胞的生长速度减慢,凋亡增加,并能够下调VEGF-A的表达下调,提示vasohibin-1可能通过调节VEGF-A的表达而参与肝癌细胞血管生成的调节,vasohibin-1有望成为肝癌基因治疗的潜在靶点。3.成功筛选出能高效沉默vasohibin-1的慢病毒表达载体,该载体能有效感染hepG2细胞株,满足实验要求。该载体的成功构建为深入开展vasohibin-1对hepG2细胞株的生物学功能和靶标研究提供了有效的工具。