新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的一种急性烈性传染病,给养禽业造成了严重的经济损失。自1926年以来ND在世界上已引发了四次大的流行,每次大的流行都由新的基因型毒株所引起,NDV一直处于不断的进化之中,目前NDV已出现了多个不同的基因型。NDV自1946年在我国首次分离至今已70多年,其在我国长期存在和流行,使养禽业发生NDV感染的风险一直存在;此外我国新城疫病毒基因型的多样性以及病毒的抗原变异,也给我国ND的防控带来了挑战。为了掌握NDV在不同禽群中的携带与感染情况,进而为临床上ND的防控提供重要依据,我们对2014-2016年华东地区不同禽群中的ND流行情况进行了监测,利用建立的NDV新型RT-PCR检测方法对分离毒株进行了基因型鉴定,并在此基础上对病毒的遗传进化进行了分析。1.检测所有NDV的一步法RT-PCR方法的建立NDV分为class Ⅰ和class Ⅱ两大类,这两类病毒之间的遗传距离远,目前对NDV分离毒株进行PCR鉴定时,往往需要分别设计针对class Ⅰ和class Ⅱ病毒基因组的特异引物。为了给临床上提供一种能够快速检测所有NDV的RT-PCR方法,我们参考了两类病毒多种基因型的F基因序列,设计出了广谱性的通用引物,在此基础上建立了可检测包括class Ⅰ和class Ⅱ在内所有毒株的一步RT-PCR方法。通过对退火温度、模板浓度、循环次数、反转录时间四个条件进行优化后,获得了 RT-PCR反应的最佳条件。不同基因型毒株的扩增结果表明该方法能成功扩增出所有受试class Ⅰ和class Ⅱ毒株的目的片段。此外新型一步RT-PCR方法扩增的片段还可以用于基因分型与毒力分析,因此该方法的建立为临床上NDV的快速鉴定提供了更为便捷的方法。2.2014-2016年华东地区活禽市场NDV的分离鉴定及遗传进化分析本文于2014-2016年在华东地区活禽市场中采集不同禽群泄殖腔棉拭样品2101份,从中分离到56份NDV阳性样品,样品的分离率为2.67%。鉴定结果显示class Ⅰ样品为42份,分离率为2%,class Ⅱ阳性样品14份,其中基因I型NDV 4株,基因Ⅱ型病毒8株,基因Ⅶ型病毒2株。遗传进化分析表明,基因Ⅰ型和Ⅱ型毒株分别与疫苗株V4和LaSota具有很高的同源性,推测其可能来源于我国广泛使用的疫苗株;基因Ⅶ型毒株为当前流行的Ⅶd2亚型。在42株class Ⅰ类NDV中,31株为鸡源,11株为水禽源,表明其在鸡群中分离率已明显高于水禽。遗传进化分析显示42株NDV全部属于3c亚型,该亚型已成为华东地区活禽市场中class Ⅰ毒株的优势基因型。3.2014-2016年临床样品中NDV的分离鉴定及遗传进化分析2014-2016年在我国江苏、山东等地收集并处理疑似病料185份,分离NDV 47株,全为class Ⅱ类病毒,其中基因Ⅰ型6株、Ⅱ型29株、Ⅶ型12株,基因Ⅰ和Ⅱ型分别与疫苗株V4和LaSota具有很高的同源性。基因Ⅶ型分离毒株的遗传进化分析显示,基因Ⅶ型分离毒株均属于基因Ⅶd2亚型,说明基因Ⅶd2亚型仍然为华东地区NDV优势流行株。Ⅶ型分离株F基因核苷酸和氨基酸之间的同源性分别为96-100%和97.5-100%;HN基因核苷酸和氨基酸之间的同源性分别为96.6-99.9%和97.6-100%。HN蛋白线性表位氨基酸位点分析发现,10/14毒株发生E347K变异,血清交叉中和试验显示HN蛋白E347K变异可对病毒的抗原性产生明显影响。此外,本文选取两株基因Ⅶd2亚型NDV进行全基因测序分析,结果显示全基因组与单个基因分别绘制的遗传进化发生树完全相似,表明新城疫病毒的进化是从基因组水平上进行的。