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一、焦磷酸测序技术行宫颈脱落细胞Hr-HPV(高危型HPV)分型检测目的：评价焦磷酸测序技术在Hr-HPV分型检测中的应用价值,分析此方法的准确性、检出高级别宫颈病变的有效性,及应用于临床检查和大规模筛查的可行性。同时获取以阴道镜门诊患者为研究人群的Hr-HPV感染比例及所感染病毒型别的分布。内容：以200名阴道镜门诊患者为研究对象,所有患者均接受宫颈液基细胞学检查(TCT)、HC-Ⅱ检测、焦磷酸测序Hr-HPV分型检查。评估焦磷酸测序技术在宫颈Hr-HPV检测中的应用价值；分析焦磷酸测序Hr-HPV检查结果与HC-Ⅱ检测的一致性；评价焦磷酸测序技术检出宫颈高级别病变(CINⅡ及以上病变)的价值；分析研究人群中Hr-HPV型别分布。方法：应用焦磷酸测序法检测12型Hr-HPV(包括HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58和59)感染。自宫颈液基细胞学检查剩余细胞中提取DNA,经HPV通用型引物扩增后,行焦磷酸测序检测以上12型Hr-HPV,其中每四种型别测序引物至于同一反应池中,仅需10分钟即可完成测序反应。分析此种检测技术与美国FDA唯一认证的HPV临床检测手段——HC-Ⅱ方法检测出Hr-HPV感染的一致性；评价其作为宫颈癌及宫颈癌前病变筛查手段的有效性；根据测序结果确定标本中特异型别的Hr-HPV感染,了解研究人群中Hr-HPV感染的型别分布。并将通用型引物PCR阳性而焦磷酸测序阴性标本的PCR产物纯化、克隆后行传统测序分型检测,确定所感染的HPV型别。结果：经焦磷酸测序检测,发现200例研究对象中Hr-HPV感染98例,其中单一感染88例,双重感染10例,检测出9种Hr-HPV感染(HPV16,HPV18,HPV31,HPV33,HPV39,HPV45,HPV52,HPV58和HPV59)。Hr-HPV感染中,HPV16感染率为69.4%,占第一位；HPV-58感染率为16.3%,占第二位。焦磷酸测序检测出的Hr-HPV感染率与宫颈病变呈正相关关系(Kendall值为0.704,P<0.001)；此方法检出高级别宫颈疾患的敏感性和特异性分别为95%和65.1%,ROC曲线下面积为0.80；焦磷酸测序检测Hr-HPV与HC-Ⅱ方法有高度的一致性(Kappa值为0.791,P<0.001)。结论：焦磷酸测序检测技术应用于Hr-HPV检测与HC-Ⅱ方法有很好地一致性,并可以进行HPV分型检测。其对宫颈CINⅡ及以上病变具有很好的检出率。是宫颈癌及癌前病变筛查的有效手段。二、应用焦磷酸测序技术对HPV16 L1片段3’端和LCR上CpG位点甲基化水平行定位、定量检测并分析与HPV16致宫颈癌作用相关性目的：应用焦磷酸测序技术定位、定量检测位于HPV16 L1片段3’端和LCR上的21个甲基化位点的甲基化率,分析比较无宫颈病变携带者、CIN患者和宫颈癌患者间各甲基化位点甲基化率差异,了解HPV16甲基化与其致病性的关系。内容：以HPV16阳性的无宫颈病变病毒携带者、CIN患者和宫颈癌患者各30例为研究对象,研究各组患者所感染HPV16病毒L1片段3’端和LCR片段甲基化位点的甲基化状态,分析评价HPV16甲基化与其致病性间关系。方法：选择HPV16阳性的无宫颈病变病毒携带者、CIN患者和宫颈癌患者各30例,使用宫颈液基细胞学检查剩余细胞提取DNA,经重亚硫酸盐处理后,分7个片段扩增HPV16 L1片段3’端和LCR区域(此区域包含E6/E7启动子增强子及E2结合位点),应用焦磷酸检测技术经测序分析检测研究片段所涉及的21个CpG位点甲基化状态,比较每一个甲基化位点甲基化率在三组患者间是否存在差异,评价HPV16甲基化与其致病性间的关系。结果：经定位、定量检测HPV16目的片段上21个CpG位点甲基化水平,发现位于E6/E7启动子的5个甲基化位点均存在随病情进展甲基化率逐渐减低趋势,在无宫颈病变病毒携带者、CIN患者和宫颈癌患者三组间存在显著性差异。位于L1片段3’端7032,7019,7136三个位点的甲基化率在三组间存在显著性差异,7032和7019位点无病变携带者甲基化率最低,宫颈癌者甲基化率最高,7136位点CIN组甲基化率最高,宫颈癌组次之,无病变者最低。结论：HPV16 L1片段3’端及E6/E7启动子CpG位点甲基化率在三组患者中存在显著性差异,这种甲基化差异可促进HPV16与宿主基因整合、E6/E7癌基因表达从而导致宫颈癌的发生。HPV16甲基化状况可能成为鉴别HPV16自愈性或致病性感染的手段,预测宫颈癌前病变及宫颈癌的发生,并且可能能够为进一步的治疗提供新的靶点。