论文部分内容阅读
白细胞介素-15(interleukin 15,IL-15)是一种T细胞生长因子,主要在除T细胞以外的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、上皮细胞及肥大细胞等多种细胞中表达。作为一种多效细胞因子,IL-15可促进NK细胞(natural killer cells,NK)和T细胞的增殖,维持NK细胞的生存,诱导细胞毒性T淋巴细胞的产生以及刺激B细胞合成免疫球蛋白。研究者发现,在类风湿关节炎、肿瘤、炎性肠病等多种免疫相关疾病中,IL-15的表达都出现异常,提示它在人类免疫系统中发挥了重要作用。在硬骨鱼中,现有的研究主要集中在IL-15基因的克隆及其表达特征的分析,但对它的免疫调节功能还知之甚少。首先,本论文运用分子克隆技术获得草鱼IL-15(grass carp IL-15,gcIL-15)的编码序列。该序列由576个核苷酸组成,共编码191个氨基酸,其N端67个氨基酸为信号肽。生物信息学分析显示得到的gcIL-15与鱼类IL-15基因结构保守,含有6个外显子和5个内含子,其氨基酸序列上的6个半胱氨酸能够形成两对二硫键,并且gcIL-15具有典型的4个?-螺旋结构。将草鱼IL-15与斑马鱼、虹鳟、青鳉、鸡、小鼠和人等物种的IL-15进行氨基酸序列比对,其一致性在12.86%到57.14%之间,并且,系统发育树结果显示草鱼IL-15与其他鱼类IL-15聚为一枝,表明所得序列为草鱼IL-15编码序列。接下来,为研究草鱼IL-15的免疫调节功能,我们尝试用多种表达方法以期获得具有生物学活性的重组草鱼IL-15蛋白(recombinant gcIL-15,rgcIL-15)。起初,我们利用酵母表达系统表达并纯化了rgcIL-15,发现该蛋白被高度糖基化,并且与其他鱼类的IL-15不同,该种方法获得的重组蛋白不能上调草鱼头肾白细胞(head kidney leucocytes,HKLs)中IFN-?mRNA的表达,提示它不具有生物学活性。考虑可能是高度糖基化影响了rgcIL-15的活性,我们改用pET-32a(+)质粒表达系统获得了可溶形式的Trx(硫氧化还原蛋白)-rgcIL-15融合蛋白,但使用该蛋白处理草鱼HKLs时同样对IFN-?mRNA的表达无影响,说明该蛋白也无生物学活性。究其原因,猜测可能是Trx蛋白影响了rgcIL-15的活性,于是我们又使用pET-30a(+)表达系统结合变复性的方法获得了可溶形式的rgcIL-15。随后的活性验证实验结果显示该方法所获rgcIL-15能以剂量依赖的方式上调草鱼HKLs中IFN-?mRNA的表达,这与虹鳟中IL-15对IFN-?的调控是一致的,说明该方法所得的重组蛋白具有生物学活性,同时也暗示gcIL-15可能参与了由IFN-?介导的抗菌防御机制。为进一步探究IL-15在草鱼HKLs中扮演的角色,使用rgcIL-15处理草鱼HKLs 3 h和24 h后,发现gcIL-15能够显著上调HKLs中IL-6、IL-1?、IL-8、IL-10等炎症相关因子的mRNA水平,同时gcIL-15还能上调HKLs中穿孔素和颗粒酶的基因表达。以上结果首次证明了gcIL-15可诱导头肾中细胞因子的基因表达,暗示gcIL-15可能通过调控炎症相关因子的表达以及影响细胞杀伤过程等途径来发挥其免疫调节功能。本论文通过对rgcIL-15蛋白表达方式的不断优化,首次成功得到了具有生物学活性的rgcIL-15,并初步探究了它在草鱼免疫器官头肾中的作用,为后续深入研究草鱼IL-15的免疫功能打下了基础。