生物标志物的研究工作对于流行病学的观察分析、临床诊断和治疗具有非常重要的意义,是了解相关疾病强有力的工具和动态的途径。生物传感技术的迅猛发展,为生物标志物的检测提供了可靠、快捷、定量、低成本和多通道的技术平台。这些生物传感平台使得与细胞生长、细胞死亡和细胞代谢相关的生物标志物和信号分子的识别成为可能。随着医学逐步向分子标记诊断和分子靶点高特异性治疗的方向发展,对于生物标志物高灵敏检测的需求也随之增加。DNA纳米技术提供了一个强大的工具来创建具有任意大小和形状控制的分子组装结构和动态分子器件,并广泛应用于材料科学和生物医学的研究。无酶核酸扩增为检测极低丰度的核酸提供了重要的平台,它既可以实现目标放大,也可以实现信号放大。本论文基于DNA纳米结构和无酶核酸放大技术,利用DNA纳米技术的独特优势,开发一系列高灵敏的新型纳米生物传感平台用于生物标志物的诊断。通过信号扩增和目标放大,实现了对目标的高灵敏度和高特异性识别,并运用于活细胞内相关生物标志物的原位成像。本论文具体开展的工作如下:生物硫醇参与可逆氧化还原反应过程和解毒、代谢等重要细胞功能,在生理基质中起着至关重要的作用。因此,对生物样品中生物硫醇的简便、灵敏和选择性检测是非常必要的。在第2章中,我们基于杂交链式反应,报道了一种新型荧光纳米传感器,利用氧化石墨烯对DNA双链和发夹DNA的选择性荧光猝灭和T-Hg2+-T配位控制杂交链式反应检测半胱氨酸和谷胱甘肽等生物硫醇,为生物硫醇检测提供了一个简单但高选择性的生物传感平台。在传感系统中,目标生物硫醇通过破坏T-Hg2+-T配位引发杂交链式反应来放大荧光信号。杂交链式反应保证了该方法的高灵敏度。氧化石墨烯作为一种优良的荧光猝灭剂,降低了背景信号,有助于进一步增强检测灵敏度。氧化石墨烯还起到信号控制器的作用,选择性吸附发夹DNA,释放长双链DNA产物。端粒酶在永生细胞的增殖中起着至关重要的作用,大多数的癌症已经被证明高表达端粒酶活性。因此,高灵敏检测细胞内端粒酶活性,对于肿瘤的早期诊断和治疗具有很大的应用前景。在第3章中,我们基于杂交链式反应和一种新型的DNA纳米结构,实现对细胞内的端粒酶活性的高灵敏检测。以链霉亲和素蛋白构建的DNA纳米结构可以作为输送载体,高效输送核酸探针至细胞内。在目标物存在的情况下,引物探针可以被延伸生成端粒重复序列,可以作为起始序列触发杂实地检测交链式反应。同时,发夹探针放大的荧光信号使端粒酶在原位可见。此外,由于所设计DNA纳米结构的特性,可以引发四个方向的杂交链式反应,生成非线性杂交链式反应产物。通过非线性杂交链式反应的扩增和DNA纳米结构的高效输送,提高了端粒酶检测的灵敏度,实现了对单个细胞端粒酶的高敏感荧光成像。DNA分子的可编程性使它们能制造进行复杂工作的动态结构。DNA纳米步行者是一种出色的动态纳米设备,可在分子层面上实现各种特殊的生物学功能。在第4章中,基于催化发夹自组装和动态DNA纳米结构,我们发展了一种基于邻近诱导分子内催化发夹装自组装的空间定位DNA纳米步行者。空间定位的DNA纳米步行者可以沿金纳米粒子表面上的三维轨道移动。有趣的是,将CHA催化回路中的DNA发夹通过空间定位限制在Y形单体上,可以极大地增加局部浓度并显示高速的动力学。而且,两足纳米步行者可以在不添加外源燃料的情况下实现自驱动行走。因为DNA纳米步行者的高速动力学和稳健的自驱动行走能力,这种渐进式移动设备在可编程电路和计算模式方面显示出巨大潜力。实时监测活细胞中特异内源性mRNA的表达水平和定位的能力为分子生物学和疾病研究提供了巨大的机遇。在第5章中,在空间定位DNA纳米步行者的基础上,我们进一步将mRNA响应信号转导为两足步行者的变化,自驱动DNA纳米步行者。通过DNA纳米步行者输出信号,实现在活细胞体内对mRNA的高灵敏荧光成像。该策略中的阻断链能够同时封闭两足步行者两端的催化活性位点,并且使得两足步行者两端催化链相互靠近,由于邻近效应,大幅度提高了杂交链之间的熔链温度,降低了背景信号。当目标mRNA存在时,会释放被封闭的两足步行者,触发分子内CHA反应。CHA反应不再受到细胞质中扩散限制的影响,也无需额外添加外源性燃料来驱动DNA纳米机器。它拓展了空间定位的纳米步行者在复杂体系中的应用,在生物系统中实现对靶标的高灵敏时空成像。